香菇多糖對(duì)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制

韓麗麗，吳 菲，黃藍(lán)萱，張淑群

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤病院，陜西西安 710004)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)近10年的發(fā)病率持續(xù)上升，目前位居全球第五大惡性腫瘤[1]。肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，缺乏有效治療手段。索拉非尼(Sorafenib)作用于迅速加速性纖維肉瘤(rapidly accelerated fibrosarcoma, RAF)激酶、血管內(nèi)皮生長因子受體22(vascular endothelial growth factor, VEGFR22)、VEGFR23、血小板源性生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR2β)及干細(xì)胞因子受體等多靶點(diǎn)，明顯延長了晚期肝癌患者的生存時(shí)間，是目前臨床上用于治療晚期肝癌的一線藥物[2]。然而，索拉非尼的耐藥現(xiàn)象在臨床上普遍存在，極大地限制了其應(yīng)用[3]。引起索拉非尼耐藥的機(jī)制目前仍不完全清楚。因此，進(jìn)一步揭示索拉非尼發(fā)生耐藥的可能機(jī)制，降低其耐藥是肝癌治療中亟待解決的問題。

香菇多糖(lentinan, LNT)是一種從香菇食用菌中提取、加工和純化的香菇子實(shí)體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)多糖成分，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。LNT在一定程度上具有抑制肝癌細(xì)胞侵襲與增殖的作用，同時(shí)具有成分穩(wěn)定、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，在臨床上廣泛用于肝癌的輔助治療。近年來，多項(xiàng)研究提示，LNT能夠通過降低腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥基因1(multi-drug resistance1 gene, MDR1)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance protein-1, MRP1)，部分逆轉(zhuǎn)膽囊癌、肺癌等腫瘤的多藥耐藥[6-8]。然而，尚無文獻(xiàn)報(bào)道LNT是否能夠逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)揭示了LNT可能通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-induced factor, HIF-1α)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)來發(fā)揮逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株BEL-7402/S對(duì)索拉非尼耐藥的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人肝癌細(xì)胞株BEL-7402購自中國上海富衡細(xì)胞中心；索拉非尼購于北京索萊寶生物科技有限公司(純度：99%)；胎牛血清購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基美國Thermo Fisher科技公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；Western blotting所用GAPDH、HIF-1α和VEGF的一抗購買于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，二抗購買于北京博奧森公司；LNT購于上海源葉生物科技有限公司(純度>98%)，呈褐色粉末，易溶于50 g/L葡萄糖溶液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)BEL-7402細(xì)胞培養(yǎng)在含150 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。1～3 d傳代1次，1.25 g/L胰酶消化傳代。

1.3 肝癌索拉非尼耐藥細(xì)胞的建立采用濃度梯度遞增法構(gòu)建BEL-7402/S耐藥細(xì)胞株，以濃度為0.5 μmol/L的索拉非尼作為起始濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，逐步進(jìn)行濃度爬坡，每次爬坡濃度約提高1.5倍，每14 d爬坡1次，最終得到穩(wěn)定的能耐受4 μmol/L索拉非尼的BEL-7402/S耐藥細(xì)胞株。BEL-7402/S細(xì)胞株培養(yǎng)在含有0.2 μmol/L索拉非尼的培養(yǎng)液以維持其耐藥性。實(shí)驗(yàn)前5～6 d，將BEL-7402/S細(xì)胞恢復(fù)至正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測LNT和索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖-毒性作用取對(duì)數(shù)生長期的BEL-7402或BEL-7402/S細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔加100 μL培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為5×104/mL。待細(xì)胞融合到80%，以梯度稀釋的方法分別加入由完全培養(yǎng)基配制的6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg/L LNT，空白對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)液)，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另設(shè)調(diào)零孔(培養(yǎng)液)。將96孔板置入37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱48 h，棄去各孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長下的吸光值(A)，利用公式細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A-空白對(duì)照平均A)/(對(duì)照組平均A-空白對(duì)照平均A)×100%，計(jì)算出LNT對(duì)兩種細(xì)胞生存率的影響以及相應(yīng)的IC50值。

檢測索拉非尼對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用與以上步驟相同，其作用濃度分別為3、6、12、24、48、96、192 μmol/L和15、30、60、120、240、480、960 μmol/L。

1.5 qRT-PCR法檢測LNT對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)的影響接種BEL-7402/S細(xì)胞(密度為5×104/mL)至6孔板，每孔2 mL，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞融合至70%時(shí)，對(duì)照組加入索拉非尼藥液(終質(zhì)量濃度為117.797 μmol/L)，實(shí)驗(yàn)組中加入LNT(終質(zhì)量濃度為16 mg/L)與索拉非尼藥液(終質(zhì)量濃度為117.797 μmol/L)。作用48 h，應(yīng)用Trizol試劑分別提取各組肝癌細(xì)胞的總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測試RNA純度和濃度；然后應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。qRT-PCR條件：25 ℃ 10 min；42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，重復(fù)40個(gè)周期。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物購自TaKaRa公司，引物序列見表1。HIF-1α和VEGF相對(duì)表達(dá)情況采用2-△△Ct法對(duì)比GAPDH表達(dá)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes for qRT-PCR analysis

1.6 Western blotting檢測LNT對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞分組、培養(yǎng)、給藥同步驟1.5。給藥干預(yù)48 h，用RIPA緩沖液分別溶解各組細(xì)胞，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。每孔加樣25 g相應(yīng)總蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗HIF-1α(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)置于4 ℃冰箱過夜。TPBS清洗膜后加入二抗，37 ℃搖床放置2 h。用DNR生物成像系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光、測試、照相。

2 結(jié) 果

2.1 LNT對(duì)BEL-7402和BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用不同濃度的LNT分別處理BEL-7402細(xì)胞和BEL-7402/S細(xì)胞48 h，兩種細(xì)胞增殖較對(duì)照組均不同程度減弱，BEL-7402細(xì)胞和BEL-7402/S細(xì)胞增殖的減弱程度無明顯差異。隨后，應(yīng)用Probit回歸分析在置信限度中估算出LNT對(duì)BEL-7402和BEL-7402/S的IC50值分別為129.912 mg/L和195.223 mg/L(圖1)。

圖1 LNT對(duì)BEL-7402和BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用

2.2 BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥性不同濃度的索拉非尼分別處理BEL-7402細(xì)胞和BEL-7402/S細(xì)胞48 h，應(yīng)用Probit回歸分析估算出索拉非尼對(duì)BEL-7402和BEL-7402/S的IC50值。索拉非尼對(duì)BEL-7402和BEL-7402/S的IC50值分別為12.812 μmol/L(圖2A)及117.797 μmol/L(圖2B)。根據(jù)耐藥指數(shù)(RI)=IC50(耐藥細(xì)胞)/IC50(親本細(xì)胞)計(jì)算得出BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的RI為9.19。

圖2 索拉非尼對(duì)BEL-7402(A)和BEL-7402/S(B)細(xì)胞的增殖-毒性作用

2.3 LNT逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥作用1、2、4、8、16、32 mg/L LNT分別聯(lián)合117.797 μmol/L索拉非尼處理BEL-7402/S細(xì)胞48 h，加入1、2、4、8 mg/L LNT聯(lián)合索拉非尼與單用索拉非尼的BEL-7402/S細(xì)胞增殖能力無明顯差異。加入16、32 mg/L LNT聯(lián)合索拉非尼的BEL-7402/S細(xì)胞增殖能力較單用索拉非尼明顯降低(圖3A)。16 mg/L的LNT即可以增加BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，提高索拉非尼對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞的抑制作用，降低IC50值，IC50值從117.797 μmol/L降至57.142 μmol/L(圖3B)。

因此，本實(shí)驗(yàn)確定16 mg/L的LNT為逆轉(zhuǎn)作用濃度。根據(jù)相對(duì)逆轉(zhuǎn)率(relative reverse rate, RRR)=[IC50(耐藥株單用化療藥)-IC50(耐藥株化療藥+逆轉(zhuǎn)劑)]/[IC50(耐藥株單用化療藥)-IC50(親本株單用化療藥)]，RRR≥1代表完全逆轉(zhuǎn)，RRR<1代表部分逆轉(zhuǎn)，LNTRRR為0.58。

圖3 LNT逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥作用

2.4 LNT對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)的影響RT-qPCR檢測16 mg/L LNT對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞中HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，LNT可以下調(diào)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA的表達(dá)(P<0.05，圖4)。

圖4 LNT對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)的影響

2.5 LNT對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)的影響Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LNT可下調(diào) BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)(P<0.05，圖5)。這提示LNT通過抑制BEL-7402/S細(xì)胞中HIF-1α及VEGF表達(dá)，實(shí)現(xiàn)部分逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥。

圖5 LNT對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

LNT是從優(yōu)質(zhì)香菇子實(shí)體中提取香菇的主要有效活性成分，具有β-(1-3)-D-葡聚糖，呈梳狀結(jié)構(gòu)。臨床與藥理研究表明，LNT具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能等作用[9-10]，臨床上廣泛用于實(shí)體惡性腫瘤的輔助治療。

針對(duì)LNT抗腫瘤機(jī)制的多項(xiàng)研究證實(shí)，其可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬，抑制腫瘤細(xì)胞血管生成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[11-13]。桂明杰等[14]報(bào)道，LNT具有抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的作用；顏亞楠等[15]發(fā)現(xiàn)，利用LNT可通過下調(diào)B淋巴細(xì)胞-2表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Bcl-2相關(guān)X蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡；還有研究表明，LNT可通過阻滯腫瘤細(xì)胞異常增殖信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。此外，張冬等[17]報(bào)道LNT明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞體外侵襲。本研究結(jié)果表明LNT可抑制肝細(xì)胞BEL-7402和BEL-7402/S的增殖，其IC50值分別為129.912 mg/L和195.223 mg/L，這為LNT可抑制肝癌細(xì)胞增殖提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

LNT逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用同樣值得研究和探討。已有研究報(bào)道，LNT可以逆轉(zhuǎn)多種腫瘤耐藥細(xì)胞株的耐藥現(xiàn)象，包括LNT與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抑制膀胱腫瘤細(xì)胞增殖具有協(xié)同作用[18]；與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)表達(dá)，激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptotic signal-regulated kinase 1, ASK1)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途徑協(xié)同發(fā)揮抑制A549增殖作用[19]。以上研究結(jié)果說明LNT可能是有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的藥物，但是否可逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥尚不清楚。本研究所建BEL-7402/S細(xì)胞株對(duì)索拉非尼的耐藥指數(shù)為9.19，后續(xù)結(jié)果顯示1、2、4、8 mg/L組的LNT在提高BEL-7402/S細(xì)胞株對(duì)索拉非尼敏感性方面無明顯作用，而16 mg/L的LNT聯(lián)合索拉非尼對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞的抑制作用較單用索拉非尼明顯增強(qiáng)。這提示LNT可以提高索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性。本研究結(jié)果還證實(shí)了與16 mg/L的LNT聯(lián)合應(yīng)用，索拉非尼對(duì)BEL-7402/S細(xì)胞IC50值為57.142 μmol/L，明顯低于單用索拉非尼的IC50值(117.797 μmol/L)，相對(duì)逆轉(zhuǎn)率RRR為 0.58。這表明LNT可部分逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥，深入研究LNT部分逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥的作用機(jī)制，具有重要臨床價(jià)值。

耐藥是導(dǎo)致索拉非尼應(yīng)用局限性的主要原因，其機(jī)制復(fù)雜且尚未被完全揭示。已有研究表明，缺氧微環(huán)境是肝癌的一個(gè)重要特征，也是誘導(dǎo)肝癌耐藥的重要機(jī)制；肝癌缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)下游VEGF表達(dá)[20]。已往研究表明，HIF-1α和腫瘤多藥耐藥蛋白P-gp、MDR1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)密切相關(guān)，對(duì)肝癌細(xì)胞多藥耐藥至關(guān)重要[21]。VEGF是體內(nèi)一種強(qiáng)效力的促血管生成因子，是HIF-1α的重要下游因子，能直接或間接參與血管生成，在肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥中具有極其重要的地位。近年來有研究表明，抑制HIF-1α的表達(dá)則提高肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性，逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥[22]。據(jù)此推測，LNT是否可通過調(diào)控HIF-1α/VEGF通路影響肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥并分別應(yīng)用RT-qPCR 和Western blotting檢測LNT對(duì)BEL-7402/S中HIF-1α及VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)，LNT對(duì)BEL-7402/S中HIF-1α及VEGF表達(dá)具有較明顯的負(fù)性調(diào)控作用。這提示LNT可通過抑制BEL-7402/S細(xì)胞中HIF-1α及VEGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)部分逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥。

綜上所述，本研究的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持LNT能夠部分逆轉(zhuǎn) BEL -7402/S細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥，這可能與其抑制肝癌細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的表達(dá)有關(guān)。但本研究僅為體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此，還需要進(jìn)一步更全面的探究和確證。