膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定脂聯(lián)素的性能評(píng)價(jià)

何敏 朱秀霞 柯杰馳 吳靜標(biāo)

【摘要】目的 ?對(duì)廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司（優(yōu)尼德）的脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。 ?方法 ?對(duì)優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒的空白吸光度、分析靈敏度、線性、準(zhǔn)確度和重復(fù)性性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，并用優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒和Mercodia Adiponection ELISA對(duì)110例臨床樣本進(jìn)行相關(guān)性分析和Bland-Altman一致性分析。 ?結(jié)果 ?優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒在0μg/mL～40μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好且相關(guān)系數(shù)r為0.998 92，準(zhǔn)確度水平1和水平2樣本的平均相對(duì)偏差分別為7.33%和6.83%，重復(fù)性水平1和水平2樣本的變異系數(shù)小于1.62%和1.49%，空白吸光度為0.758 78，分析靈敏度為0.095 9，與Mercodia Adiponection ELISA比對(duì)具有良好的相關(guān)性。 ?結(jié)論 ?優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒空白吸光度小、分析靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，與Mercodia Adiponection ELISA進(jìn)行比對(duì)，一致性良好，符合臨床實(shí)驗(yàn)室要求。

【關(guān)鍵字】 脂聯(lián)素;膠乳增強(qiáng)免疫比濁法;性能評(píng)價(jià)

基金項(xiàng)目：典型免疫和分子診斷計(jì)量技術(shù)、儀器研究及產(chǎn)業(yè)公共服務(wù)平臺(tái)建設(shè)（20202004071900008）

脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的蛋白類激素，屬于脂肪因子家族的一員，大量存在于血液循環(huán)中，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性及葡萄糖代謝的過程中起到重要作用，是目前發(fā)現(xiàn)的與體脂含量呈負(fù)相關(guān)的脂類、糖類代謝重要調(diào)控因子。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，罹患糖尿病、心血管疾病及相關(guān)并發(fā)癥的患者APN水平遠(yuǎn)低于健康人群。因此APN在心血管疾病和糖尿病及其綜合征等疾病中具有臨床應(yīng)用價(jià)值，可以為這些疾病的預(yù)防和預(yù)后提供參考。

檢索國家藥品監(jiān)督管理局國產(chǎn)醫(yī)療器械數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)APN檢測(cè)試劑盒擁有有效注冊(cè)證的公司僅有9家，方法學(xué)包括基于膠乳增強(qiáng)免疫比濁法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法，其中膠乳增強(qiáng)免疫比濁法占5家。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)需人工操作、耗時(shí)長，不適合單樣本檢測(cè);化學(xué)發(fā)光法的雖然靈敏度高，但是其檢測(cè)需要特定的化學(xué)發(fā)光儀，成本較高，臨床檢測(cè)中應(yīng)用范圍較小;優(yōu)尼德的脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）試劑盒配有所需的所有試劑，包括比濁試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，即開即用，不需要額外試劑或提前準(zhǔn)備，且適用各種型號(hào)的生化分析儀，使用方便。

本研究通過使用廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司（以下簡(jiǎn)稱優(yōu)尼德）的脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）測(cè)定臨床血清樣本中的APN水平，考察該試劑盒的試劑空白吸光度、分析靈敏度、線性、準(zhǔn)確度和重復(fù)性，全面評(píng)價(jià)優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒的性能指標(biāo)，以期為未來使用脂聯(lián)素試劑盒進(jìn)行臨床診斷提供指導(dǎo)與性能參考。

1材料和方法

1.1一般資料

參照EP9-A2和《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，選取2018年1月至2018年12月湖北省新華醫(yī)院檢驗(yàn)科110例糖尿病患者和普通血糖測(cè)試者的臨床樣本，其中男63例，女47例，平均年齡（51.23±16.48）歲。試劑空白吸光度、靈敏度、線性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性試驗(yàn)所用樣本為企業(yè)參考品。

1.2儀器和試劑

考核系統(tǒng)儀器：全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：BS380，廠家：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

對(duì)照系統(tǒng)儀器：酶標(biāo)儀（型號(hào)：Epoch，廠家：美國BioTek Instruments）。

考核系統(tǒng)試劑：脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）（批號(hào)：3610020170821，廠家：優(yōu)尼德），APN校準(zhǔn)品（批號(hào)：380520170822，廠家：優(yōu)尼德），APN質(zhì)控品（批號(hào)：370520170822，廠家：優(yōu)尼德）。

對(duì)照系統(tǒng)試劑：Mercodia Adiponection ELISA（批號(hào)：27565，廠家：瑞典Mercodia AB）。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1試劑空白吸光度試驗(yàn)：使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒重復(fù)測(cè)定蒸餾水3次，并記錄吸光度A2，A2均值除以100 00即為試劑空白吸光度測(cè)定值。

1.3.2靈敏度試驗(yàn)：使用優(yōu)尼德試劑盒檢測(cè)10.0μg/mL的脂聯(lián)素蛋白配制而成的樣本，記錄測(cè)試過程終點(diǎn)吸光度與起始吸光度的差值△A。

1.3.3線性試驗(yàn)：線性范圍也是分析范圍，指分析方法能直接測(cè)定的待測(cè)物濃度或質(zhì)量的范圍。稀釋高濃度血清樣本為從高至低5個(gè)梯度的理論濃度（40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、1.0μg/mL），每個(gè)濃度水平檢測(cè)3次，求均值。以理論濃度為自變量，以檢測(cè)結(jié)果均值為因變量求出線性回歸方程。

1.3.4準(zhǔn)確度試驗(yàn)：根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（the National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）EP5-A2對(duì)準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)的要求，每天使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒對(duì)水平1樣品、水平2樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)及相對(duì)誤差，以評(píng)價(jià)試劑的準(zhǔn)確性。

1.3.5重復(fù)性試驗(yàn)：使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒分別對(duì)兩個(gè)濃度水平質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定，每份濃度水平樣品重復(fù)測(cè)定10次，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.3.6方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn)：使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）和Mercodia Adiponection ELISA試劑盒，分別對(duì)湖北省新華醫(yī)院檢驗(yàn)科的110例臨床標(biāo)本進(jìn)行定量分析，作直線回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 試劑空白吸光度試驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)尼德試劑盒試劑的空白吸光度均值為0.758 78。

2.2靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)尼德試劑盒試劑的吸光度差值為0.095 9。

2.3線性試驗(yàn)結(jié)果

線性的R2=0.997 8，相關(guān)系數(shù)R=0.998 92，見表1和圖1。

2.4準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

水平1樣本的平均相對(duì)偏差為7.33%，水平2樣本的平均相對(duì)偏差為6.83%，見表2。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

水平1和水平2的變異系數(shù)分別為1.62%和1.49%，見表3。

2.6 方法學(xué)比對(duì)分析和Bland-Altam分析

對(duì)優(yōu)尼德與Mercodia的檢測(cè)結(jié)果作散點(diǎn)圖，得到R2=0.991 3，相關(guān)系數(shù) R=0.995 9>0.95，直線回歸方程為Y=1.024 3X-0.086 4，試驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果均具有良好線性關(guān)系。見圖2。

以試驗(yàn)組與對(duì)照組的均值為橫坐標(biāo)，比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行Bland-Altam分析，僅有4/110（3.6%）在95%一致性界限以外，一致性界限為（0.87，1.12），見圖3。

3 討論

脂聯(lián)素是由apM1基因編碼的一種含244個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，由氨基端非螺旋功能區(qū)、N-末端信號(hào)肽、膠原樣結(jié)構(gòu)域和C-末端的球狀結(jié)構(gòu)域組成，脂聯(lián)素的球狀結(jié)構(gòu)域與膠原蛋白VIII和X以及補(bǔ)體因子C1q25蛋白質(zhì)同源，能促進(jìn)脂聯(lián)素與脂聯(lián)素受體的結(jié)合。apM1基因位于人類3q27號(hào)染色體上，編碼一種由肝臟脂肪細(xì)胞所分泌的內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì)ADPN。ADPN是一種非常重要的心血管保護(hù)因子，在調(diào)節(jié)能量代謝（比如糖代謝和肪肪代謝）、炎癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化等起著重要作用，是重要的糖尿病早篩生物標(biāo)記物。ADPN的N-末端膠原樣結(jié)構(gòu)域通過賴氨酸殘基的羥基化和糖基化形成脂聯(lián)素三聚體復(fù)合物，脂聯(lián)素的三聚體通過二硫鍵結(jié)合成六聚體或高分子量脂聯(lián)素多聚體，這些多聚體是循環(huán)脂聯(lián)素的主要形式，也是脂聯(lián)素免疫比濁測(cè)定試劑盒的檢測(cè)靶標(biāo)。目前中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院內(nèi)分泌科尤麗麗等人使用優(yōu)尼德的脂聯(lián)素免疫比濁測(cè)定試劑盒成功確立了健康人的血漿脂聯(lián)素水平的參考范圍為男性>3 mg/L，女性>3.4 mg/L 。

作為對(duì)照組的Mercodia公司長期專注于代謝紊亂領(lǐng)域尤其是糖尿病和肥胖領(lǐng)域的Elisa臨床診斷和科研方面的應(yīng)用。Mercodia的質(zhì)量體系由QSR管理，并通過了ISO13485的認(rèn)證，其產(chǎn)品出口世界上100多個(gè)國家。Mecodia的檢測(cè)試劑盒均使用單克隆抗體（單克隆抗體具有單一的抗原決定簇）和一流的原料，使其試劑盒具有非常高的靈敏度和特異性，可以保證實(shí)驗(yàn)的高度重復(fù)性。2009年，Mercodia被評(píng)為為全球胰島素檢測(cè)的最權(quán)威機(jī)構(gòu)之一，是WHO推薦的提供金標(biāo)準(zhǔn)方法和產(chǎn)品的權(quán)威公司。Mercodia的Elisa法脂聯(lián)素檢測(cè)試劑盒作為Mercodia胰島素檢測(cè)系列產(chǎn)品廣泛被醫(yī)院所使用。

本研究通過對(duì)優(yōu)尼德脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）的性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，并與瑞典Mercodia的Adiponection ELISA試劑盒進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)研究，測(cè)定結(jié)果具有極高的一致性。利用Bland-Altman法作為圖形分析法，顯示優(yōu)尼德和Mercodia公司兩種檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)ADPN測(cè)量結(jié)果一致性良好，優(yōu)尼德的檢測(cè)系統(tǒng)適用于ADPN檢測(cè)。優(yōu)尼德的脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）在脂聯(lián)素檢測(cè)上具有樣本測(cè)試速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確度、重復(fù)性結(jié)果良好，試劑穩(wěn)定性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以為相關(guān)疾病的臨床評(píng)價(jià)提供精確指導(dǎo)。

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