單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片與熒光原位雜交在流產(chǎn)絨毛組織遺傳學分析中的比較研究*

黃 艷，王曉華，侯東霞，白瑞芳，侯麗青，冀小平

內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院遺傳優(yōu)生科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020

臨床上常用細胞染色體核型分析來診斷染色體疾病，雖然可以檢出所有染色體非整倍體的數(shù)目異常及>5 Mb的染色體結構異常[1]，但是傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)、染色體核型分析需要的工作周期較長(15個工作日)。熒光原位雜交(FISH)的最大優(yōu)勢在于不僅可用于中期染色體的檢測，而且可以用于間期核染色體的檢測[2]，同時也彌補了檢測周期的缺陷，約3～5個工作日可出結果。然而，F(xiàn)ISH技術的高成功率僅表現(xiàn)于對染色體數(shù)目異常的檢測，不能檢測染色體的結構異常[3]。染色體微陣列分析(CMA)技術，包括微陣列比較基因組雜交技術和單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP-array)技術，是新近發(fā)展起來的一種快速、高效的分子核型分析技術，不僅能檢出拷貝數(shù)變異(CNVs)，還能檢測出雜合性缺失、單親二倍體和低水平的嵌合體[3-4]。本院自2016年開始開展SNP-array技術，臨床應用效果較好，本研究采用SNP-array技術和FISH技術對稽留流產(chǎn)絨毛組織進行檢測、比較，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年11月至2019年8月內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院稽留流產(chǎn)的632例患者為研究對象。納入標準：(1)符合稽留流產(chǎn)相關診斷標準[5]；(2)23～40歲；(3)流產(chǎn)孕周6～13周。排除標準：(1)有子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等影響胚胎著床、發(fā)育的因素；(2)男方精子不成熟[5-7]。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法 隨機選取632例研究對象中181例患者作為試驗組，采用SNP-array技術檢測胚胎染色體；另選取451例患者作為對照組，采用FISH技術檢測胚胎染色體。

試驗組：無菌操作下取流產(chǎn)絨毛組織，離心，按總RNA試劑盒(德國Promega公司)要求抽提DNA，測定濃度和純度。按 Affymetrix Cytoscan 750K芯片的要求對提取的DNA進行操作，通過酶切、連接、擴增、純化、片段化、標記，與Affymetrix Cytoscan 750K芯片進行雜交、孵育、洗滌、染色。采用 Affymetrix Genechip Scanner 3000Dx掃描系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行采集，CHAS軟件進行分析。

對照組：去除蛻膜、血塊等雜質(zhì)后，挑選絨毛組織5 mg剪碎成絨毛枝，進行消化、預固定、固定，將固定后的細胞懸液滴片，在73 ℃烤箱中烤片30 min。將制備好的玻片進行漂洗、消化、脫水后，加探針，76 ℃變性7 min后迅速置于37 ℃的水浴箱中，雜交前取出。選用特異性探針進行雜交過夜(條件42 ℃)。熒光顯微鏡下細胞計數(shù)>100個，當檢測到染色體異常>60%時為陽性，提示異常標本；<10%為陰性，提示正常標本；在10%～60%為嵌合體。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1兩組檢出染色體異常的種類 采用SNP-array技術成功檢測試驗組181例患者的絨毛組織，其中檢出染色體異常104例(57.46%)，包括非整倍體83例，整倍體10例，微缺失微重復CNVs 11例(2例CNVs致病性不明確的病例，夫婦拒絕芯片驗證，故無法獲得遺傳學來源)。對照組檢測451例，絨毛組織標本的間期FISH均獲得雜交信號，其中檢出染色體異常197例(43.68%)，包括非整倍體177例，整倍體20例。與對照組比較，試驗組對染色體異常的檢出率更高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.829 7，P<0.05)。

2.2兩組染色體非整倍體異常的檢出情況 試驗組非整倍體異常標本中，最常見的為16-三體，共16例，另有22-三體10例(含1例嵌合)，21-三體6例(含1例嵌合)，13-三體5例(含1例嵌合)；單體主要發(fā)生在X染色體(共10例)。對照組非整倍體異常標本中，以16-三體最多，共105例，另有45,X染色體30例，22-三體18例，21-三體11例，13-三體6例，18-三體3例，嵌合體及其他染色體異常4例。見表1。

2.3試驗組染色體微缺失微重復的檢出情況 試驗組中4例單一位點缺失或重復標本中，缺失2例，其中8號染色體缺失1例，17號染色體缺失1例；單一位點重復2例，其中X染色體重復1例，13號染色體重復1例；7例標本同時具有2個或2個以上的位點缺失或重復。另有結果顯示，試驗組SNP-array技術檢測出13q13.3q34二體、三體嵌合；對照組FISH檢測出16-三體和45,X染色體。見表2，圖1、2。

表1 兩組染色體非整倍體異常的檢出情況[n(%)]

表2 試驗組染色體微缺失微重復的異常情況

圖1 FISH檢測16-三體

圖2 FISH檢測45,X染色體

3 討 論

SNP-array技術可發(fā)現(xiàn)所有的染色體數(shù)目異常，可以識別并檢測染色體的重排，包括基因組序列的獲得與丟失，并且其可有效檢測出基因組所存在的不平衡問題[8-9]。SNP-array技術是通過檢測DNA CNVs實現(xiàn)的，結論可分為良性、可能良性、不明確、可能致病和致病5種類型[10]。結合基因組變異數(shù)據(jù)庫(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、人類染色體失衡和表型數(shù)據(jù)庫(https://decipher.sanger.ac.uk/)，以及專門收錄于基因組中(包括CNVs里可遺傳的或遺傳性基因疾病)的在線孟德爾遺傳性疾病數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)，可獲取具體的基因序列、位點、疾病及相關研究[11-12]，可以在線查詢相關CNVs的信息。SNP-array芯片檢測不能識別如下染色體異常：(1)平衡易位、倒位攜帶者；(2)低比例嵌合體者(嵌合率低于30%)。FISH技術是利用熒光標記的DNA探針與待測標本DNA序列進行雜交，針對常見的染色體非整倍體(13、16、18、21、22-三體及性染色體數(shù)目異常)，根據(jù)雜交信號的有無及類型達到診斷目的[13-15]。本研究通過SNP-array技術與FISH技術檢測流產(chǎn)絨毛組織，得出如下結論。

SNP-array技術的檢測范圍及檢出率高于FISH技術。孕婦發(fā)生自然流產(chǎn)的病因很復雜，胚胎或胎兒染色體異常是早期流產(chǎn)最常見的原因，約占50%～60%[16]。染色體數(shù)目異常是引起自發(fā)流產(chǎn)的最主要遺傳因素[17]，本研究表明，試驗組染色體數(shù)目異常(非整倍體和整倍體異常)共93例，占所有染色體異常的89.42%。FISH技術作為一種靶向檢測技術，不能對整個染色體組進行檢測。由于方法學的限制，F(xiàn)ISH技術只能檢測13、16、18、21、22及性染色體的數(shù)目異常，其他染色體異常則無法檢測，也無法檢測這6條染色體探針區(qū)域以外的片段是否發(fā)生了缺失、重復、易位或倒位[18]。本研究中FISH技術對染色體異常的檢出率只有43.68%(197/451)；而SNP-array技術可發(fā)現(xiàn)所有的染色體數(shù)目異常，染色體異常的檢出率為57.46%。試驗組中除染色體數(shù)目異常還檢出CNVs 11例，其中5例為常規(guī)染色體核型分析無法發(fā)現(xiàn)的<10 Mb的CNVs。2例CNVs意義未明，需要夫妻雙方進行SNP-array技術驗證，只有檢測其來源，才能為下次妊娠提供指導，但夫婦拒絕驗證，因此無法進一步明確結果。試驗組對染色體異常的檢出率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.829 7，P<0.05)。

流產(chǎn)胚胎染色體以16-三體、22-三體和45，X染色體最常見。本研究中，試驗組用SNP-array技術檢出的染色體異常包括非整倍體、整倍體及染色體微缺失和微重復，其中染色體非整倍體發(fā)生率最高。試驗組染色體非整倍體異常的發(fā)生率為79.81%(83/104)，染色體非整倍體異常又以16-三體最為常見，22-三體和45，X染色體的發(fā)生率并列排第2位。對照組中染色體非整倍體異常的發(fā)生率為89.85%(177/197)，F(xiàn)ISH技術檢測到的染色體異常以16-三體為最常見，其次是45，X染色體和22-三體，發(fā)生率排第2位和3位。

綜上所述，在檢查自然流產(chǎn)妊娠物染色體異常的效果上，SNP-array技術明顯優(yōu)于以往的FISH技術，值得臨床應用推廣。該技術在自然流產(chǎn)分子遺傳學分析中有顯著優(yōu)越性，因此，有必要對稽留流產(chǎn)患者進行SNP-array技術檢測，不但可以明確病因，更能為患者提供遺傳咨詢和再生育指導[19]。