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      大黃蟲丸對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)A549細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

      2021-01-13 12:58:43蔣鋒利黃茂蔡松任士杰孫文麗張晶趙明鏡張立山
      世界中醫(yī)藥 2021年24期
      關(guān)鍵詞:含藥肺纖維化充質(zhì)

      蔣鋒利 黃茂 蔡松 任士杰 孫文麗 張晶 趙明鏡 張立山

      摘要 目的:基于“IPF患者存在肺絡(luò)干血”假說,觀察大黃蟲丸含藥血清對TGF-β1誘導(dǎo)后A549細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及Smad3,Collagen Ⅲ表達的影響,探討其防治特發(fā)性肺纖維化(IPF)的作用機制。方法:正常培養(yǎng)并取對數(shù)生長期A549細胞,TGF-β1對其誘導(dǎo)48 h,電子顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)學(xué)變化;選擇吡非尼酮(PFD)為陽性對照藥,RT-PCR法檢測EMT相關(guān)基因及Smad3 mRNA的表達;Western Blottingting法檢測Smad3,p-Smad3,Collagen Ⅲ蛋白表達。結(jié)果:成功獲取發(fā)生EMT的A549細胞;以α-SMA mRNA表達情況判斷EMT程度由高到低依次為:模型組(M),大黃蟲丸含藥血清大劑量組(D),西藥組(P),大黃蟲丸含藥血清中劑量組(Z),大黃蟲丸含藥血清小劑量組(X),空白對照組(K);與M組比較,Z組,X組,P組中Collagen Ⅲ表達不同程度降低(P<0.05),且其在Z組與K組中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與M組及K組比較,各觀察組Smad3表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但對其基因及磷酸化,即Smad3 mRNA及p-Smad3的表達有影響,且與M組比較,Z組,X組,P組中均不同程度降低(P<0.05),D組中表達雖低于M組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:大黃蟲丸對TGF-β1誘導(dǎo)后A549細胞發(fā)生EMT程度與Smad3 mRNA及Collagen Ⅲ的表達有影響,推測大黃蟲丸對IPF的保護機制可能與不同程度阻斷或逆轉(zhuǎn)了TGF-β1/Smad3介導(dǎo)的EMT有關(guān)。

      關(guān)鍵詞 大黃蟲丸;肺絡(luò)干血;特發(fā)性肺纖維化;含藥血清;上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;α-平滑肌肌動蛋白;Ⅲ型膠原蛋白

      Abstract Objective:To observe the effects of Dahuang Zhechong Pills-containing serum on EMT and the expression of Smad3 and Collagen Ⅲ Protein in A549 cells after TGF-β1 induction based on the hypothesis of “the presence of pulmonary collateral hard blood in IPF patients”,and to explore its role in the prevention and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis mechanism.Methods:Normally we grew and took A549 cells in logarithmic growth phase,TGF-β1 intervened for 48 h,observed the morphological changes of A549 cells under electron microscope; choosed pirfenidone as a positive control drug,RT-PCR method to detect the expression of EMT related genes and Smad3 mRNA; Western Blotting was used to detect the expression of Smad3,p-smad3,Collagen Ⅲ protein.Results:The A549 cells with EMT were successfully obtained; the degree of EMT was determined from α-SMA mRNA expression in order from high to low:model group(M),large-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum(D),Western medicine group(P),middle-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum(Z),little-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum(X),blank control group(K); Compared with M,the expression of Collagen Ⅲ in Z,X,and P decreased to varying degrees(P<0.05),and there was no difference in the expression of Z and K(P>0.05); compared with M and K,there was no difference in the expression of Smad3 in each experimental group(P>0.05),but it had an effect on the expression of its genes and phosphorylation,that is,the expression of Smad3 mRNA and p-smad3.All of them decreased in different degrees(P<0.05).Although the expression in D was lower than M,it was not statistically significant(P>0.05).Conclusion:Dahuang Zhechong Pills has the effect on EMT and the expression of Smad3 mRNA and Collagen Ⅲ in A549 cells after TGF-β1 induction.It is speculated that the protective mechanism of Dahuang Zhechong Pills on IPF may be related to the blocking or reversal of EMT mediated by TGF-β/Smad3 to varying degrees.

      Keywords Dahuang Zhechong Pills; Pulmonary collateral hard blood; IPF; Drug-containing serum; EMT; TGF-β1; α-SMA; Collagen Ⅲ

      中圖分類號:R289.5文獻標識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.007

      特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是一種原因不明,慢性進展,致死性間質(zhì)性肺病,隸屬中醫(yī)“肺痿”“肺痹”范疇,亦有醫(yī)家將其歸為“喘證”,病性為本虛標實。該病以間充質(zhì)細胞聚集體和能表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA),且能促進有絲分裂及細胞外基質(zhì)(ECM)分泌增加的肌成纖維細胞構(gòu)成的“成纖維細胞灶”為其病理特征[1]。武維屏,姜良鐸為代表的中醫(yī)肺病專家提出“肺系絡(luò)病”理論,將其病機概括為“氣虛血瘀,痰熱互結(jié),痹阻肺絡(luò)”[2-3]?;谝陨险J識,我們提出“IPF患者存在肺絡(luò)干血”的假說,認為“肺絡(luò)干血是肺纖維化病因,細胞外基質(zhì)沉積是干血實質(zhì)”[4]。針對“干血”一證,張仲景治以“緩中補虛”之大黃蟲丸,尤在涇將本方治法概括為“潤以濡其干,蟲以動其瘀,通以去其閉”,實為仲景治療“干血”的三大法門。

      前期實驗中,我們證實大黃蟲丸對博來霉素致IPF大鼠的保護作用可能通過抑制MMP-2的產(chǎn)生來實現(xiàn)[5]。本實驗通過制備不同濃度大黃蟲丸含藥血清,正常培養(yǎng)并取對數(shù)生長期A549細胞進行實驗,TGF-β1(5 ng/mL)對其誘導(dǎo)48 h,電子顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)學(xué)變化;選擇吡非尼酮作為陽性對照藥,RT-PCR法檢測EMT相關(guān)基因及Smad3 mRNA的表達;Western Blotting法檢測Smad3,p-Smad3,Collagen Ⅲ蛋白表達,以期探索大黃蟲丸對IPF防治作用的更多內(nèi)在機制,進一步豐富捜剔肺絡(luò)法防治IPF的學(xué)術(shù)內(nèi)涵。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 動物與細胞 選取健康SD雄性大鼠60只,體質(zhì)量250~300 g。由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供,SPF/VAF級,許可證號:SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境,濕度為5%~10%,溫度(22±2)℃,12 h/12 h光照/暗循環(huán),可以自由獲取食物和飲水。本實驗通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院倫理委員會審批(倫理審批號:19-34)。

      人肺泡上皮A549細胞株(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫,北京)。

      1.1.2 藥物 大黃蟲丸(北京同仁堂,國藥準字:Z11020002,批號:17013170);注射用鹽酸博來霉素(杭州瀚暉制藥有限公司,國藥準字:H20055883,批號:19033911);吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業(yè),國藥準字:H20133376,批號:190505)。

      1.1.3 試劑與儀器 總RNA提取試劑盒(北京基譜生物,貨號:GPQ1801),Smad3抗體(Abcam公司,美國,貨號:ab40854),p-Smad3抗體(CST公司,美國,貨號:9520),Ⅲ型膠原蛋白抗體(Proteintech公司,美國,貨號:22734-1-AP),Actin抗體(Abcam公司,美國,貨號:ab6276),山羊抗鼠IgG,HRP(Abcam公司,美國,貨號:ab6789)。二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO公司,日本,型號:MC0175),離心機(Eppendorf公司,德國,型號:Centrifuge 5415D),倒置顯微鏡(OLYMPUS公司,日本,型號:CKX41),熒光定量PCR儀(杭州博日科技,型號:9600Plus),分光光度計(Thermo scientific公司,美國,型號:GENESYSTM 50),溫控搖床(海門其林貝爾,型號:TS-2000A),電泳儀(北京凱元信瑞,型號:PP-1150)。

      1.2 方法

      1.2.1 大黃蟲丸含藥血清的制備及保存 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,參照盧磊等[6]方法制備含藥血清。按人與動物等效劑量換算法,分別算得大黃蟲丸大,中,小及吡非尼酮的給藥劑量為1.8 g/(kg·d),0.9 g/(kg·d),0.45 g/(kg·d)及0.18 g/(kg·d),以上劑量分別各給10只SD大鼠灌服,1次/d,持續(xù)7 d。末次給藥1 h后,3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)腹腔內(nèi)麻醉,無菌條件腹主動脈取血,冰上靜置2 h,4 ℃,3 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15 min取上清液,分裝并標記,56 ℃滅活30 min,-80 ℃快速凍固保存,待用。剩余20只SD大鼠灌以等量等滲鹽水,以同樣方法制備空白血清并保存,待用。

      1.2.2 實驗分組與造模 實驗分為空白對照組(K組),模型組(M組),西藥組(P組),模型+大黃蟲丸含藥血清大劑量組(D組),模型+大黃蟲丸含藥血清中劑量組(Z),模型+大黃蟲丸含藥血清小劑量組(X組)。參照Hidenori Kasai等的方法復(fù)制IPF細胞模型[7]。收集對數(shù)生長期A549細胞,調(diào)整細胞懸液濃度至5×104/mL,每孔2.5 mL接種于6孔板,2組均設(shè)3個復(fù)孔,37 ℃,5%CO2條件下,培養(yǎng)24 h。換液,均加入無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基2.5 mL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。換液,K組每孔加入2.5 mL培養(yǎng)基,其余各組每孔加入2.5 mL相應(yīng)含TGF-β1(5 ng/mL)及藥物血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡下觀察并拍照。見圖1。結(jié)合2.2中,M組與K組比較,E-cadherin mRNA表達顯著降低(P<0.01),間充質(zhì)標志α-SMA mRNA表達顯著升高(P<0.01),表明IPF細胞模型成功[8]。

      1.2.3 RT-PCR法檢測EMT及Smad3相關(guān)基因表達 不同濃度大黃蟲丸含藥血清對TGF-β1誘導(dǎo)48 h后A549細胞表達上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)mRNA,α-SMA mRNA,Smad3 mRNA情況的影響。獲取1.2.2中各觀察組細胞,按總RNA提取試劑盒(DNaseⅠ)試劑盒說明提取細胞樣本中總RNA并定量,1%瓊脂糖凝膠進行電泳,檢測RNA的完整性。按mRNA cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。按mRNA/lncRNA qPCR試劑盒說明進行擴增,反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s,(95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s)×45個循環(huán),同時在60~95 ℃進行融解曲線分析,采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對表達強度分析,所有樣本均設(shè)3個重復(fù)。引物設(shè)計由北京基譜生物科技有限公司完成。見表1。

      1.2.4 Western Blotting法檢測Smad3,p-Smad3,Collagen Ⅲ蛋白表達

      Western Blotting法檢測不同濃度大黃蟲丸含藥血清對TGF-β1誘導(dǎo)48 h后A549細胞表達Smad3,p-Smad3,Collagen Ⅲ蛋白情況的影響。重復(fù)1.2.2實驗分組及細胞培養(yǎng)過程,獲取TGF-β1誘導(dǎo)48 h后A549細胞。按蛋白質(zhì)提取試劑盒(北京基譜生物,貨號:GPP1815)說明進行蛋白提取,BCA法蛋白定量,依照電泳上樣量需要用SDS-PAGE上樣緩沖液(5×)調(diào)整蛋白濃度,100 ℃煮沸變性10 min備用。配制12%的分離膠,5%濃縮膠。算得待檢測蛋白樣品上樣量60 μg,濃縮膠恒壓80 V,約20 min;分離膠恒壓120 V,電泳至溴酚藍到凝膠底部。2 h恒流300 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%BSA室溫封閉1 h。將PVDF膜置于雜交袋中,分別加入配制好的一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,10 min/次,加入相應(yīng)二抗,室溫孵育1 h。TBST洗膜3次,10 min/次。按ECL Plus Western Blotting Kit試劑盒說明暗室中曝光,顯影并定影。

      條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進行讀取,除以內(nèi)參Actin灰度值,即得樣品中目標蛋白的相對表達量,所有樣本均設(shè)3個重復(fù)。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,各組間差異用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 M組和K組組織學(xué)結(jié)果

      M組中A549細胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)48 h,形態(tài)逐漸由鵝卵石狀變?yōu)樯扉L的紡錘形或梭形,細胞圓形度降低,與成纖維細胞,肌纖維母細胞形態(tài)相似。見圖1。

      2.3 各組Smad3,p-Smad3,Collagen Ⅲ蛋白表達 ? 與K組比較,M組中Collagen Ⅲ、Smad3和p-Smad3的表達較K組顯著增加(P<0.01),說明TGF-β1誘導(dǎo)48 h后的A549細胞核轉(zhuǎn)錄過程十分活躍。PFD處理后,與M組比較,P中Collagen Ⅲ、Smad3和p-Smad3的表達顯著降低(P<0.05)。同樣的,在D組、Z組和X組中也觀察到這種現(xiàn)象。當劑量為0.45 g/(kg·d)時,則顯示出較好的治療效果。見圖2,表3。

      3 討論

      轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是一種多功能細胞因子,具有促進細胞增殖,分化,凋亡及ECM形成等生物活性,被認為是誘導(dǎo)包括肺在內(nèi)諸多臟器纖維化的“主開關(guān)”[9]。肺損傷的患者和動物的肺纖維化中已發(fā)現(xiàn)TGF-β1過表達[10-11],且TGF-β1作為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)誘導(dǎo)劑在包括肝臟,腎近端小管,晶體等上皮細胞中已被證實[12]。在IPF進展中,肺泡及氣道上皮中均發(fā)現(xiàn)存在EMT,其中肺泡上皮細胞(AEC)是肺纖維化的主要致病介質(zhì)[13]。α-SMA表達說明成纖維細胞分化為成肌纖維細胞,是ECM信號的來源,且這一過程促進了肺損傷的發(fā)展[14]。另外,α-SMA,I型膠原,Ⅲ型膠原,纖連蛋白及波形蛋白消融可減輕小鼠肺組織樣本中的纖維化[15]。Smads是TGF-β超家族細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子,該信號通路與人類諸多疾病的發(fā)生密切相關(guān)[16]。除Smads介導(dǎo)的細胞核轉(zhuǎn)錄外,TGF-β還可以激活包括促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途徑,Rho樣GTPase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT等多種信號途徑來促使臟器纖維化[17]。

      前期研究中證實,EMT可以被多種中藥制劑阻斷或逆轉(zhuǎn),表現(xiàn)出對IPF的保護。柴胡皂苷D可通過mTOR信號通路抑制A549細胞EMT,且呈明顯的劑量-時間依賴關(guān)系[18]。姜黃素通過Wnt3a/β-catenin信號通路抑制EMT,從而阻斷胃癌細胞(MKN45)的增殖,遷移及侵襲[19];姜黃素可逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的肝癌細胞(HepG2)增殖和遷移能力增加,可能與其抑制缺氧誘導(dǎo)的HIF1-α蛋白上調(diào)和EMT有關(guān)[20]。黃芩苷通過TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑減輕因輻射誘導(dǎo)Ⅱ型AEC發(fā)生的EMT[21]。穿心蓮內(nèi)酯通過TGF-β1介導(dǎo)的Smads依賴性和非依賴性途徑抑制T細胞的增殖和成纖維細胞分化,從而改善了博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[22]。槲皮素通過增加E-cadherin表達,降低神經(jīng)性鈣黏蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)表達,使得TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細胞(SMMC-7721)EMT得到明顯抑制[23]。白藜蘆醇通過阻斷TGF-β1/Smad3信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的人肺上皮細胞A549的增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[24]。人參皂苷Rg1可能通過抑制EMT來改善COPD大鼠小氣道纖維化[25]。黃芪甲苷可通過AKT/β-catenin信號通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細胞(HMrSV5)EMT程度[26]。大黃素通過抑制TGF-β1/ADAMTS-1信號抑制肺成纖維細胞增殖及其EMT,并減少Ⅰ/Ⅲ型膠原合成[27]。

      本研究中,E-cadherin mRNA表達降低與α-SMA mRNA表達升高為發(fā)生EMT的標志。如結(jié)果所示,α-SMA mRNA表達由高到低依次為:M組,D組,P組,Z組,X組,K組。與M組比較,除D組外其余組,作為間充質(zhì)細胞標志α-SMA mRNA表達均顯著降低(P<0.01),提示中小劑量大黃蟲丸可顯著改善TGF-β1誘導(dǎo)48 h后A549細胞EMT程度,且效果上X組優(yōu)于P組(P>0.05)。作為衡量IPF程度的重要指標,亦是ECM重要成分的Collagen Ⅲ表達由高到低依次為:M組,D組,P組,Z組,X組,K組。本研究結(jié)果還提示大黃蟲丸可不同程度抑制TGF-β1誘導(dǎo)48 h后A549細胞表達Smad3 mRNA及p-Smad3,且大體上與劑量呈負相關(guān),進而影響TGF-β1/Smad3信號通路介導(dǎo)的EMT程度,起到抗纖維化作用,且此過程可能受到其他與EMT相關(guān)信號通路的影響,尚需進一步研究證實。此外,與M組比較,D組中表達α-SMA mRNA,Collagen Ⅲ雖不同程度降低,但均無差異(P>0.05),且E-cadherin mRNA的表達甚至為各用藥組最低,即其抑制EMT效果最差。提示大黃蟲丸對IPF的保護作用可呈雙向性,劑量的選擇是主要影響因素。

      綜上所述,TGF-β1/Smads信號通路在IPF的發(fā)生與進展中起重要作用,作為正向調(diào)節(jié)劑,磷酸化Smad3過表達可促進與TGF-β1信號密切相關(guān)的EMT發(fā)生。本研究結(jié)果表明,大黃蟲丸對TGF-β1誘導(dǎo)后A549細胞發(fā)生EMT程度與Smad3基因及磷酸化的表達有影響,推測大黃蟲丸對IPF的保護機制可能與不同程度阻斷或逆轉(zhuǎn)了TGF-β1/Smad3介導(dǎo)的EMT有關(guān),為大黃蟲丸可作為IPF患者的潛在有效治療藥物提供了更多科學(xué)依據(jù)。

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      (2020-06-16收稿 責(zé)任編輯:張雄杰)

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