穿心蓮內(nèi)酯類成分積累與生物合成的調(diào)控研究進(jìn)展

鐘楚 簡少芬 陳東亮 繆劍華

摘 要：穿心蓮是我國重要的南藥之一，其主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯類成分具有清熱解毒、抗菌消炎等功效，在抗HIV病毒、抗血栓、保肝等方面具有顯著效果。由于其人工合成困難，通過栽培調(diào)控或育種方法增強(qiáng)穿心蓮體內(nèi)內(nèi)酯類成分的生物合成對提升穿心蓮藥材質(zhì)量具有重要意義。為給相關(guān)研究提供參考，該文綜述了穿心蓮內(nèi)酯類成分積累與植物發(fā)育的關(guān)系，栽培措施和環(huán)境因子對穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的影響，以及近十年來國內(nèi)外在穿心蓮內(nèi)酯類成分的生物合成及其分子調(diào)控機(jī)制等方面取得的研究進(jìn)展，并提出了未來在以增強(qiáng)穿心蓮內(nèi)酯類成分生物合成和提高穿心蓮內(nèi)酯類成分積累為目標(biāo)的研究中需重點關(guān)注的3個方面：（1）深入解析穿心蓮內(nèi)酯的生物合成通路及關(guān)鍵基因的功能，從分子水平上闡明穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的機(jī)制;（2）結(jié)合分子生物學(xué)方法和作物栽培學(xué)理論深入研究穿心蓮生長發(fā)育與產(chǎn)量和質(zhì)量形成的規(guī)律及相互關(guān)系;（3）揭示穿心蓮內(nèi)酯生物合成的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

關(guān)鍵詞：穿心蓮，環(huán)境因子，穿心蓮內(nèi)酯，生物合成，植物激素

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）10-1746-09

Abstract：Andrographis paniculata，known as ‘Chuanxinlian’ in China，is an important southern medicine in China. Its main active ingredients，andrographolide components，has good pesticide effects on heat-clearing and anti-bacterial and anti-inflammatory，etc. Modern medical research has demonstrated that they also have profound effects in anti-HIV，anti-thrombus，liver protection and so on. Because they are difficult to be synthesized artificially，to increase the biosynthesis of andrographolide components in A. paniculata by cultivation regulation and breeding methods is of great significance to improve the quality of this medicinal material. To provide reference for related research in these fields，this paper reviewed the relationship between accumulation of andrographolide components and plant development，the effects of cultivation measures and environmental factors on the accumulation of andrographolide components，and the research advances in biosynthesis of andrographolide components and its molecular regulatory mechanism in the last decade worldwide. We also put forward three aspects which should be focused on in future studies aiming at enhancing the biosynthesis and accumulation of andrographolides components in A. paniculata：（1） To further identify the biosynthetic pathway of andrographolide components and the functions of key genes，and to elucidate the mechanism of andrographolides accumulation at molecular level; （2） To deeply study the laws of growth and development，yield and quality formation，and their interrelations in A. paniculata with the combination of molecular biological approaches and crop cultivation theories; （3） To reveal the signal regulation network in the biosynthesis of andrographolide components.

Key words：Andrographis paniculata，environmental factors，andrographolide，biosynthesis，phytohormone

穿心蓮（Andrographis paniculata）是爵床科一年生草本藥用植物，喜光照充足、高溫濕潤氣候，一般認(rèn)為它起源于南亞的印度和斯里蘭卡（Raina et al.，2013），在印度、東南亞各國、中國和日本等世界各傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)中占有重要地位。穿心蓮常用于黃疸、皮膚病、消化不良、退熱及精神障礙等疾病的治療（Mishra et al.，2007）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯在抗HIV病毒、抗炎、抗血栓、保肝等方面具有顯著效果（Mishra et al.，2007; Aromdee，2012; Xu et al.，2012; Talei et al.，2014）。穿心蓮內(nèi)酯屬于半日花烷型二萜內(nèi)酯類化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成困難，主要依靠從植物原料藥中提取。因此，提高原料藥中穿心蓮內(nèi)酯含量是穿心蓮藥材栽培和育種的重要目標(biāo)。

本文總結(jié)了近十年來國內(nèi)外在穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的栽培措施與環(huán)境因子調(diào)控研究等方面取得的進(jìn)展，并介紹了穿心蓮內(nèi)酯類成分的生物合成通路及其分子調(diào)控機(jī)制，以期為穿心蓮優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)及開展深入的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究提供有價值的參考。

1 穿心蓮內(nèi)酯類成分的積累規(guī)律

藥用植物活性成分的積累與植物的發(fā)育階段密切相關(guān)。穿心蓮內(nèi)酯類成分積累隨生育時期的變化有明顯的規(guī)律，了解這種變化規(guī)律是進(jìn)一步開展穿心蓮栽培與內(nèi)酯生物合成調(diào)控研究的基礎(chǔ)。穿心蓮內(nèi)酯類成分主要存在于葉片中，葉片穿心蓮內(nèi)酯含量在營養(yǎng)生長期增長迅速，進(jìn)入生殖生長后增長變慢，在開花始期達(dá)最高，開花后隨著植株的衰老發(fā)生降解而下降（王振華等，2007;曾令杰等，2007;Kumar & Kumar，2013;陳娟等，2014a）。因此，在開花期以前收獲穿心蓮可以獲得較高內(nèi)酯產(chǎn)量。王振華等（2007）研究表明，開花期對穿心蓮內(nèi)酯的積累影響較大，開花期越晚，生長期越長，內(nèi)酯含量越高。脫水穿心蓮內(nèi)酯含量在整個生育期內(nèi)沒有明顯的變化規(guī)律，且含量較低（王振華等，2007;曾令杰等，2007），與始花期呈負(fù)相關(guān)，即開花期越晚，脫水穿心蓮內(nèi)酯含量越低（王振華等，2007）。這說明穿心蓮不同內(nèi)酯成分積累的調(diào)控模式可能存在差異。穿心蓮內(nèi)酯與開花期的關(guān)系對穿心蓮優(yōu)良品種的選育有很好的參考意義，選育開花期較晚的品種可以提高穿心蓮生物產(chǎn)量和內(nèi)酯產(chǎn)量。

代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，穿心蓮老葉中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯均較幼葉有所降低，與葉片中葡萄糖和膽堿含量的變化一致（Tajidin et al.，2019）。這說明穿心蓮內(nèi)酯類成分的變化可能受初生物質(zhì)代謝的影響。開花期是植物物質(zhì)生產(chǎn)與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折期，穿心蓮內(nèi)酯類成分隨生育時期的變化規(guī)律與體內(nèi)初生代謝的關(guān)系值得進(jìn)一步研究，將有助于揭示穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制。此外，Pholphana et al.（2013）比較了溫室和大田種植的穿心蓮內(nèi)酯類成分的變化，發(fā)現(xiàn)溫室條件下葉片穿心蓮內(nèi)酯在種子形成期含量最高 [（24.72±1.89）mg·g-1]，而大田條件下則是營養(yǎng)生長期最高 [（43.16±0.92） mg·g-1]?？梢?，生長環(huán)境會影響穿心蓮內(nèi)酯積累隨生育時期的變化規(guī)律。

2 栽培措施對穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的影響

2.1 播期和種植方式（模式）對穿心蓮內(nèi)酯類成分的影響

國內(nèi)穿心蓮主要分布于長江以南的廣西、廣東、福建等亞熱帶地區(qū)。近年來，隨著對穿心蓮藥材需求的增加，穿心蓮引種不斷北移，目前在云南、四川、浙江、江蘇、江西、山東、北京等地都有種植。由于種植地域分布廣，各地溫度差異較大，因此播種時間跨度從4月上旬到5月上旬。一般在南方地區(qū)，穿心蓮最佳播期為4月上旬，能獲得較高的產(chǎn)量和穿心蓮內(nèi)酯含量（莊文彬，2008;王振等，2018）。雖然播期影響穿心蓮產(chǎn)量和內(nèi)酯成分含量，但對開花期沒有顯著影響（Kaushal et al.，2010）。上文已提到開花期是影響穿心蓮內(nèi)酯成分的關(guān)鍵時期，因此可利用穿心蓮的這種特性適當(dāng)早播以延長其營養(yǎng)生長期，有利于增加干物質(zhì)積累量，從而提高穿心蓮產(chǎn)量和內(nèi)酯含量。

穿心蓮種植方式主要有直播和育苗移栽，而種植模式主要有單作和套作（邵艷華等，2014）。目前還沒有關(guān)于穿心蓮不同種植方式和種植模式對內(nèi)酯類成分影響的系統(tǒng)比較研究，但直播通常具有較大的群體密度，可能影響植株的生長和養(yǎng)分吸收利用，不利于穿心蓮內(nèi)酯類成分的積累。穿心蓮單作有利于植株充分利用太陽光，能提高穿心蓮內(nèi)酯類成分的含量，但選擇合適的套種作物（如春玉米）不影響穿心蓮中后期的生長和內(nèi)酯類成分的積累（韋坤華等，2013）。

2.2 種植密度對穿心蓮內(nèi)酯類成分的影響

穿心蓮能耐受一定程度的密植。廣西地區(qū)穿心蓮種植密度在每公頃16.5萬～18萬株時產(chǎn)量最高（周靈芝等，2014），而Singh et al.（2011）與Kumar & Kumar（2013）的研究一致認(rèn)為，印度北部地區(qū)穿心蓮的適宜種植密度為30 cm × 15 cm，即每公頃約22.2萬株。不同地區(qū)穿心蓮最適種植密度的差異可能與各地光、熱、養(yǎng)分等因素差異有關(guān)。Singh et al.（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在每公頃22.2萬株密度下穿心蓮生物產(chǎn)量、穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯含量最高。推測認(rèn)為，較密集的群體對光、水、肥等資源的利用率更高而促進(jìn)產(chǎn)量增加，而較高的產(chǎn)量有利于穿心蓮內(nèi)酯類成分的積累。

種植密度可能通過穿心蓮改變株型而影響其干物質(zhì)積累，進(jìn)而影響內(nèi)酯含量。密植條件下，穿心蓮單株的生長受到抑制，表現(xiàn)為株高增加、冠幅減小、分枝數(shù)減少、分枝與主莖的夾角變小，而單位面積干物質(zhì)產(chǎn)量增加（Singh et al.，2011）。對穿心蓮農(nóng)藝性狀與4個內(nèi)酯成分之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯與單株葉片數(shù)和分蘗個數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，去氧穿心蓮內(nèi)酯與葉片數(shù)和干重相關(guān)指標(biāo)也呈顯著負(fù)相關(guān)，而與葉長呈正相關(guān)（曾吳靜等，2019）。以上分析表明，穿心蓮生長與內(nèi)酯類成分積累之間存在一定的權(quán)衡關(guān)系，適當(dāng)抑制生長有利于提高內(nèi)酯成分含量。內(nèi)酯成分含量與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性為高活性成分穿心蓮品種的選育提供了重要的表型參考依據(jù)。

2.3 養(yǎng)分運籌對穿心蓮內(nèi)酯類成分的影響

穿心蓮以全草入藥，獲取較高的生物量是穿心蓮種植的首要目標(biāo)，而施肥是獲得高產(chǎn)的重要途徑之一。平衡施肥改善作物產(chǎn)量和品質(zhì)。大田施肥試驗證明，由于充足的養(yǎng)分有利于穿心蓮的生長和內(nèi)酯成分的積累（邵艷華等，2014），因此應(yīng)注重氮磷鉀和有機(jī)肥配施（丁楠等，2008），有機(jī)肥配施NPK和生物肥的穿心蓮生長和內(nèi)酯產(chǎn)量最佳（Hemalatha & Suresh，2012）。

氮是植物需求量最大的營養(yǎng)元素，參與植物的各生理代謝過程。唐章亮（2006）在廣西的研究表明，穿心蓮的需肥量較大，最適的施氮量達(dá)172.5 kg N·hm-2。而Patidar et al.（2011）對印度穿心蓮的研究表明，穿心蓮內(nèi)酯在施氮量為0～80 kg N·hm-2時隨氮水平升高而迅速增加，當(dāng)施氮量達(dá)100 kg N·hm-2時反而下降。但是，Patidar et al.（2011）的結(jié)果可能并不具有參考價值，因為他們測得的穿心蓮內(nèi)酯（主要內(nèi)酯成分）含量最高僅為0.178%，遠(yuǎn)低于《中華人民共和國藥典》（2020年版一部）規(guī)定的穿心蓮藥材中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的總量不得少于1.5%的要求（國家藥典委員會，2020）。通常缺氮條件下藥用植物酚類、萜類等不含氮的次生代謝物含量增加，即符合碳/營養(yǎng)平衡假說（Fritz et al.，2006; Ibrahim et al.，2012; 王靜等，2012），而最佳施氮量的存在說明氮對穿心蓮生長和內(nèi)酯合成的影響可能并不完全符合該假說，也說明氮對穿心蓮生長與次生代謝權(quán)衡的調(diào)控作用較為復(fù)雜，氮肥運籌對它們之間關(guān)系影響的機(jī)理仍值得進(jìn)一步探討。

3 環(huán)境因子對穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的調(diào)控

對不同產(chǎn)地穿心蓮樣品的分析發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯含量存在很大差異（韋坤華等，2013;鄧喬華等，2014;邵艷華等，2014），一般認(rèn)為環(huán)境因子是影響穿心蓮內(nèi)酯成分變化的重要因素。環(huán)境因子對穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的調(diào)控研究目前主要集中在光照、土壤微生物和鹽脅迫等3個方面。

3.1 光照強(qiáng)度和光質(zhì)對穿心蓮內(nèi)酯類成分的影響

太陽光是植物光合作用的能量來源，是影響植物生長和生物量積累的重要因素之一。陳娟等（2014a）對穿心蓮光合作用的光響應(yīng)特征分析發(fā)現(xiàn)，旺盛生長期穿心蓮葉片的最大凈光合速率僅為4 μmol·m-2·s-1，光飽和點和光補(bǔ)償點分別為800 μmol·m-2·s-1和100 μmol·m-2·s-1，當(dāng)光強(qiáng)超過1 000 μmol·m-2·s-1時發(fā)生光抑制現(xiàn)象。但是，筆者測定發(fā)現(xiàn)，穿心蓮最大凈光合速率可達(dá)20 μmol·m-2·s-1，光飽和點也超過2 000 μmol·m-2·s-1（圖1），具有典型的喜陽植物特征。研究穿心蓮光合作用對光強(qiáng)的響應(yīng)特征對其種植模式的選擇具有很好的理論指導(dǎo)作用。利用穿心蓮的需光特性，生產(chǎn)上通常采用穿心蓮與春玉米套種的方式以獲得較高的土地經(jīng)濟(jì)收益。生長前期，玉米可以為穿心蓮遮蔭，以防烈日曝曬灼苗，生長中后期玉米收獲后對穿心蓮的光照影響已消除，有利于穿心蓮內(nèi)酯類成分的積累（邵艷華等，2014;周靈芝等，2014），而桉樹林或香蕉林下長期光照弱，光照時間短，導(dǎo)致套種穿心蓮的內(nèi)酯類成分較低（邵艷華等，2014）。因此，生產(chǎn)上常采用穿心蓮/玉米、穿心蓮/花生等套種模式。

目前，關(guān)于光強(qiáng)對穿心蓮內(nèi)酯類成分的影響研究還沒有一致的結(jié)論。李婷等（2016）和Purwanto et al.（2011）研究發(fā)現(xiàn)，隨著光強(qiáng)減弱，穿心蓮內(nèi)酯含量逐漸增加。而其他研究發(fā)現(xiàn)，自然條件下適度遮蔭可以促進(jìn)穿心蓮的生長，穿心蓮內(nèi)酯含量受影響不大，而過度遮蔭嚴(yán)重影響植株生長和內(nèi)酯含量（褚晨亮和曾令杰，2013;邵艷華等，2014）。因為光影響植物的形態(tài)建成，所以光強(qiáng)可能通過影響穿心蓮的物質(zhì)合成與分配進(jìn)一步影響內(nèi)酯類成分的積累。

光質(zhì)是影響植物形態(tài)建成、作物品質(zhì)和藥用植物活性成分的重要因素（李強(qiáng)等，2017）。通過覆蓋不同顏色的透明薄膜，褚晨亮等（2013）研究發(fā)現(xiàn)紅膜能增加穿心蓮株高和提高穿心蓮總內(nèi)酯含量，而藍(lán)膜和黃膜都不利于穿心蓮的生長和內(nèi)酯成分的積累。紅光對藥用植物活性成分積累的促進(jìn)作用在山豆根（王美英等，2013）和丹參（梁宗鎖等，2012）等植物上也有報道，但其作用機(jī)制尚未深入研究。由于植物體內(nèi)光敏色素的表達(dá)能響應(yīng)光質(zhì)的變化（牛驤等，2017），所以推測光受體基因可能參與了藥用植物活性成分合成的調(diào)控。在煙草上已證明光受體基因NtphyB表達(dá)水平的改變會影響煙草的形態(tài)和次生代謝物，其中生物堿、總多酚、綠原酸和蕓香苷的含量與NtphyB基因表達(dá)水平的變化趨勢一致（羅永露等，2014）。該研究對進(jìn)一步解析光質(zhì)影響穿心蓮內(nèi)酯類成分積累的分子機(jī)制有一定的參考和借鑒意義。

3.2 土壤微生物對穿心蓮內(nèi)酯類成分的影響

藥用植物與其生長環(huán)境中的土壤微生物關(guān)系密切（張連娟等，2017），兩者之間的相互作用已成為藥用植物次生代謝調(diào)控研究的熱點（Kberl et al.，2013）。穿心蓮接種芽孢桿菌（Bacillus sp.）可使穿心蓮內(nèi)酯產(chǎn)量提高28%～61%（Verma et al.，2015）。叢枝菌根真菌（AMF）是最為古老且物種稀少的植物根部共生真菌，在已研究過的陸生植物中有90%均能與其形成共生關(guān)系。AMF在增加植物礦質(zhì)營養(yǎng)吸收、改善植物生長狀況、提高作物產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等方面具有重要作用（鄒碧瑩和張云翼，2008;Helgason & Fitter，2009）。對穿心蓮接種AMF雖能顯著提高植株生長和穿心蓮內(nèi)酯含量，但不同種類的AMF對穿心蓮的影響不盡相同，其中以Glomus leptotichum和G. intraradices的效果最好（Chiramel et al.，2006）。同時，還觀察到接種AMF不同程度地提高了穿心蓮植株磷含量，其中地上部增加了31.68%～127.57%，地下部增加了19.58%～43.55%（Chiramel et al.，2006）。AMF對植物磷營養(yǎng)的改善作用被認(rèn)為是促進(jìn)植物生長和活性物質(zhì)積累的重要原因（黃京華等，2011），而AMF是否還通過其他生理過程影響植物活性成分的積累尚有待進(jìn)一步驗證。

3.3 鹽脅迫對穿心蓮內(nèi)酯類成分的影響

穿心蓮具有一定的耐鹽性，但不同遺傳材料間差異較大（Talei et al.，2012）。陳娟等（2014a）采用土壤盆栽試驗研究表明，穿心蓮在0.4%的NaCl濃度內(nèi)可正常生長，說明其具有中度耐鹽能力。Shao et al.（2015）采用2∶1紅土和泥炭作為培養(yǎng)基，在Hoagland營養(yǎng)液中添加不同NaCl濃度處理，發(fā)現(xiàn)41.1 mmol·L-1 NaCl（電導(dǎo)率為4 dS·m-1）對穿心蓮的株高和葉面積沒有顯著影響;而當(dāng)NaCl濃度達(dá)92.4 mmol·L-1（電導(dǎo)率為8 dS·m-1）時，植株生長明顯受到抑制，且抑制程度隨NaCl濃度增加而加大。Talei et al.（2013）以相對生長速率（RGR）和耐鹽指數(shù)（STI）為評價指標(biāo)，通過設(shè)置不同鹽濃度和處理時間研究了穿心蓮的耐鹽閾值，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理5 d時生長開始下降，12 dS·m-1鹽脅迫處理15 d是穿心蓮能耐受的鹽脅迫閾值?？寡趸{迫和光合作用相關(guān)蛋白對鹽脅迫有響應(yīng)，且1個17 kDa 和1個45 kDa的蛋白分別對光合作用和穿心蓮內(nèi)酯起作用（Talei et al.，2014; 2015）。對穿心蓮耐鹽脅迫及其機(jī)制的研究，為開展穿心蓮耐鹽品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

隨著鹽濃度的增加穿心蓮內(nèi)酯含量雖顯著提高，但鹽脅迫導(dǎo)致的穿心蓮生物量下降通常可達(dá)50%，而穿心蓮內(nèi)酯含量的增加最多不過30%（Talei et al.，2013;Shao et al.，2015）。由此可見，穿心蓮含量的增加更多是因為生物量下降而導(dǎo)致的濃縮效應(yīng)，并非逆境誘導(dǎo)次生代謝增強(qiáng)的結(jié)果。因此，應(yīng)結(jié)合穿心蓮內(nèi)酯合成相關(guān)基因的表達(dá)分析，才能正確評估鹽脅迫對穿心蓮內(nèi)酯積累的效應(yīng)。

4 穿心蓮內(nèi)酯類成分的生物合成通路及其分子調(diào)控機(jī)制

4.1 穿心蓮內(nèi)酯類成分的生物合成途徑

植物萜類化合物都是由五碳結(jié)構(gòu)——二磷酸異戊烯基（IPP）和其烯丙基異構(gòu)體——二磷酸二甲基烯丙基（DMPP）為基本單元進(jìn)一步轉(zhuǎn)化而來。它們通過兩條位于不同亞細(xì)胞空間的途徑合成，即質(zhì)體中的甲基赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的甲羥戊酸（MVA）途徑。前者以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸為原料，后者則以乙酰輔酶A為原料（王凌健等，2013;Tholl，2015）。Srivastava & Akhila（2010）通過放射性同位素示蹤，證明了MEP和MVA途徑共同促進(jìn)穿心蓮內(nèi)酯的積累，且MEP途徑是穿心蓮內(nèi)酯的主要生物合成途徑。

焦磷酸香葉基香葉酯（GGPP）是穿心蓮內(nèi)酯合成的主要前體物質(zhì)，GGPP環(huán)合生成ent-焦磷酸古巴酯（ent-CPP）是穿心蓮內(nèi)酯生物合成的關(guān)鍵步驟，催化該反應(yīng)的二萜合酶——ent-柯巴基焦磷酸合酶（CPS）是穿心蓮內(nèi)酯生物合成的關(guān)鍵限速酶。2012年已克隆到了穿心蓮CPS的編碼基因，命名為ApCPS，GenBank登錄號為JN216843.1（姚攀等，2012）。通過病毒誘導(dǎo)基因沉默（諶琴琴等，2016）、多倍體（郭鵬等，2019）和生長時期動態(tài)基因表達(dá)（陳娟等，2014b）等研究均證明，ApCPS的表達(dá)量與穿心蓮內(nèi)酯積累有很好的相關(guān)性。因此，ApCPS是穿心蓮內(nèi)酯生物合成的關(guān)鍵酶基因。Misra et al.（2015）對ApCPS2的功能進(jìn)行了描述。Sun et al.（2019）通過對穿心蓮全基因組測序找到5個ApCPS基因（ApCPS1-5），并描述了ApCPS1和ApCPS3的功能。

目前，穿心蓮ent-CPP的生物合成通路雖已基本明確，但由其下游中間產(chǎn)物到穿心蓮內(nèi)酯類成分的合成途徑仍了解較少。Sun et al.（2019）在穿心蓮全基因組測序的基礎(chǔ)上，對茉莉酸甲酯（MeJA）處理的穿心蓮植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定了可能參與穿心蓮內(nèi)酯類成分合成的酶基因，包括細(xì)胞色素P450單加氧酶、依賴于2-酮戊二酸的雙加氧酶和依賴于UDP的糖基轉(zhuǎn)移酶，并鑒定出一個糖基轉(zhuǎn)移酶能催化雄激素的O-連接葡萄糖基化作用產(chǎn)生新穿心蓮內(nèi)酯（圖2）。

4.2 穿心蓮內(nèi)酯類成分合成的分子調(diào)控機(jī)制

除ApCPS外，其他萜類代謝基因?qū)Υ┬纳弮?nèi)酯類成分的生物合成也有重要調(diào)控作用。ApCPS基因沉默15 d后穿心蓮內(nèi)酯積累量顯著下降，上游牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPS）基因的表達(dá)也下調(diào)，而3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因和1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）基因的表達(dá)未受影響。諶琴琴等（2016）研究結(jié)果表明，ApCPS對穿心蓮內(nèi)酯合成基因具有反饋調(diào)節(jié)作用，同時也暗示穿心蓮內(nèi)酯生物合成的調(diào)控主要集中在GGPS和ApCPS兩個基因。

植物生長發(fā)育和代謝受植物激素的調(diào)控。植物激素作為刺激因子參與植物次生物質(zhì)合成的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑（王春麗和梁宗鎖，2009）。脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）和茉莉酸（JA）等都能誘導(dǎo)穿心蓮內(nèi)酯含量的提高，且該作用與萜類代謝基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)（Anuradha et al.，2010; Jha et al.，2011）。MeJA是調(diào)控植物防御反應(yīng)的重要植物激素，MeJA在人參皂苷（王康宇等，2017）、紫杉醇（李娟花等，2011）、萜烯類（吳琦等，2018）等次生物質(zhì)合成中的作用已有廣泛報道。MeJA可誘導(dǎo)穿心蓮生物合成途徑中GGPP內(nèi)含子保留型異構(gòu)體的差異表達(dá)（Gao et al.，2019）。Sharma et al.（2015）以不同MeJA濃度處理穿心蓮懸浮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5 μmol·L-1 MeJA處理24 h的穿心蓮內(nèi)酯含量達(dá)最高，較對照提高了5.25倍，穿心蓮內(nèi)酯含量的提高與MVA和MEP途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，其中，ISPH、GGPS和HMGS的表達(dá)對穿心蓮內(nèi)酯的合成影響顯著。諶琴琴等（2016）的研究表明，MeJA能廣泛調(diào)控穿心蓮萜類代謝相關(guān)基因HMGR、DXS、GGPS等的表達(dá)，且對這些基因的誘導(dǎo)時間早于ApCPS。可見，ApCPS在一定程度上受上游基因的調(diào)控。

藥用植物次生代謝的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制研究是闡明藥材品質(zhì)形成機(jī)理的重要內(nèi)容（鄒琳等，2015）。然而，目前對穿心蓮內(nèi)酯合成的分子調(diào)控機(jī)制研究還只是關(guān)注于少數(shù)關(guān)鍵基因的表達(dá)與內(nèi)酯成分含量之間的關(guān)系，而對于其上游基因的互作，以及環(huán)境因子誘導(dǎo)內(nèi)酯成分合成的信號通路研究仍然不足。

5 問題與展望

近十年來，隨著人們對穿心蓮研究的重視和分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在穿心蓮內(nèi)酯類成分的生物合成及調(diào)控方面取得了巨大進(jìn)展。但是，同大宗作物和模式植物比較起來，穿心蓮的相關(guān)研究不僅滯后，而且研究工作缺乏系統(tǒng)性。傳統(tǒng)農(nóng)作物和模式植物在現(xiàn)代植物生物學(xué)領(lǐng)域取得的先進(jìn)研究成果對穿心蓮相關(guān)研究具有重要的借鑒作用。筆者認(rèn)為，未來對穿心蓮內(nèi)酯類成分生物合成和調(diào)控的研究應(yīng)重點關(guān)注以下幾個方面。

（1）深入解析穿心蓮內(nèi)酯的生物合成通路及關(guān)鍵基因的功能。對穿心蓮內(nèi)酯生物合成通路的解析是從分子水平上闡明穿心蓮內(nèi)酯合成積累對環(huán)境和刺激因子響應(yīng)規(guī)律的基礎(chǔ)。盡管對穿心蓮內(nèi)酯合成通路上游的一些關(guān)鍵酶已有一定的了解，但對其生物合成的完整途徑，以及基因之間的相互作用關(guān)系仍不十分清楚。GGPP同時是赤霉素、類胡蘿卜素、葉綠素等物質(zhì)合成的前體（Tholl，2015），對穿心蓮內(nèi)酯合成通路的解析有助于我們了解穿心蓮二萜類物質(zhì)代謝的分流機(jī)制，以及不同內(nèi)酯成分之間的關(guān)系。

（2）開展穿心蓮栽培理論與技術(shù)的深入研究。藥用植物栽培理論和技術(shù)研究普遍滯后于傳統(tǒng)農(nóng)作物的研究（Gao et al.，2020），在很多方面仍處于起步或初步探索階段?，F(xiàn)代作物栽培學(xué)已發(fā)展了完善的栽培理論體系，包括葉齡模式、源庫理論、群體質(zhì)量理論和化學(xué)調(diào)控理論。以分子生物學(xué)方法結(jié)合作物栽培學(xué)基本理論為指導(dǎo)，研究穿心蓮生長發(fā)育、產(chǎn)量和質(zhì)量形成規(guī)律，將為穿心蓮生長調(diào)控、群體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、產(chǎn)量與質(zhì)量的平衡等提供重要的科學(xué)理論支撐。

（3）加強(qiáng)穿心蓮內(nèi)酯生物合成的信號調(diào)控通路研究。次生物質(zhì)代謝作為植物響應(yīng)生長環(huán)境變化的重要生理過程，受體內(nèi)復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，這也是采取栽培調(diào)控措施或環(huán)境刺激因子提高藥用植物次生活性成分積累的重要理論基礎(chǔ)。研究穿心蓮內(nèi)酯生物合成過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對通過基因的精準(zhǔn)調(diào)控促進(jìn)穿心蓮內(nèi)酯積累將起到重要的推動作用。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）