不同長勢古樹土壤真菌群落組成和多樣性

黎煒彬 嚴朝東 張 浩 蘇純蘭 陳葵仙 劉頌頌

（1.東莞市林業(yè)科學研究所，廣東 東莞 523000；2.香港園藝專業(yè)學會，香港 999077）

珍稀罕有的古樹名木，是我國林業(yè)資源的瑰寶，也是生物多樣性保護的重要組成部分[1]。古樹名木易受當地自然環(huán)境、風俗人情、歷史文化以及社會發(fā)展等因素影響。由于古樹樹齡大，樹勢較一般植株衰弱，抵抗病原菌侵害能力低下，往往存在空洞或枯木現象，故此，易被有害菌、如木材腐朽菌等侵染[2]。土傳性木材腐朽菌是導致木材腐朽病的主要病原菌之一[3]。盡管我國對林木土壤真菌多樣性的研究較廣泛，但主要集中于森林公園及各種植被比較豐富的自然保護區(qū)[4-8]，對于古樹名木根際土壤真菌群落組成與多樣性的報道卻極為匱乏。

植物根際真菌是土壤中重要的分解者，參與生態(tài)系統(tǒng)中的物質循環(huán)、能量流動和信息傳遞[9-10]。土壤真菌在分解地表枯落物、礦化有機質、提升土壤質量和為植物根系提供營養(yǎng)等方面發(fā)揮著重要作用[11]。探究真菌在古樹名木根際土壤中的群落構成及其多樣性特征，對古樹名木保護具有重要指導意義。近年來對古樹名木的土壤真菌多樣性研究以分離培養(yǎng)法為主，但該方法通常實驗周期長、準確率不高、操作難度大，不能實現快速有效檢測與評價的目的[12]。古樹名木根際土壤真菌總量大，群落組成復雜，且較大部分的真菌難以通過上述方法分離，因此傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法并不能全面地反映土壤真菌群落的多樣性[13]。目前，關于微生物分類鑒定或系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究，主要的技術方案是內轉錄間隔區(qū)（ITS）鑒定[14]。第2代基因測序技術具有通量大、時間短、成本低、讀取長度適中等優(yōu)點，與rDNA轉錄區(qū)相比，ITS具有更高的突變率，可以準確地分類具有遺傳關系的菌株[15]，在環(huán)境生態(tài)[16-17]、醫(yī)學醫(yī)療等有關研究領域得到廣泛應用。

東莞市（22°39′～23°09′N，113°31′～114°15′E）地處廣東省中南部，珠江口東岸，東江下游的珠江三角洲，屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫為23.1 ℃，年均日照時數為1 873.7 h，年降水量為1 800 mm以上，地帶性植被主要為熱帶季風常綠闊葉林，是森林植物易繁衍的區(qū)域。古樹名木由于生長環(huán)境不同，健康狀況各異，可能會導致其土壤真菌的群落組成與多樣性有差異。本研究以東莞市3種長勢（正常、衰弱和瀕危）的古樹名木為對象，運用第2代高通量DNA測序技術（Illumina MiSeq平臺），探明上述3種長勢古樹名木根際土壤真菌的群落構成與多樣性特點，旨在揭示古樹名木長勢和土壤真菌群落的關系，為古樹名木的健康預警和精準保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 古樹名木調查與長勢評價

2019年初，對東莞全市古樹名木進行實地調查。研究對象為廣東省古樹名木信息管理系統(tǒng)（http://121.33.231.227:8070/）[18]中具有木腐病癥狀的古樹名木及其根際土壤。初步篩選出疑似患病古樹名木75株，其中散生54株，群生21株。1級古樹5株，2級古樹8株，3級古樹60株，名木2株，隸屬于24科46屬54種。疑患木腐病古樹名木以細葉榕（Ficus microcarpa）為主，占總株數40%，其余潺槁樹（Litsea glutinosa）、刺桐（Erythrina variegata）及土沉香（Aquilaria sinensis）等52種古樹名木每種僅有1～2株。據調查顯示[19]，上述古樹名木根際土壤包括赤紅壤、山地紅壤及山地黃壤等，土壤平均pH值為4.42。

長勢評價參考蘇純蘭等[20]的古樹健康狀況評價標準（表1），并根據調查情況作出修改，共設正常（ZC）、衰弱（SR）和瀕危（BW）3個長勢組，每個調查點采樣與評價面積為古樹名木的滴水面積。

表1 東莞市古樹名木長勢評價描述Table 1 Evaluation and description of growth potential of ancient and famous trees in Dongguan City

1.2 土壤樣品采集

基于對古樹名木的保護，本次取樣將采自大樹、古樹5～20 cm土層側根或須根系表面0.5～1 cm范圍內的土壤視為根際土壤，每株疑似患病古樹隨機選取3～5個樣點，采集時用采樣鏟除去地表的雜物及洞口的大枝條和樹葉，多點采集的根際土壤充分混合后置于無菌自封袋中，合計75份土樣，以廣東省古樹統(tǒng)一編號命名并暫存于干冰泡沫箱內，不設置重復。帶回實驗室后于4 ℃下保存，長期保存的土壤速凍后于-80 ℃保存。土壤預處理：土壤樣品先除去其中的石子和動植物殘體等異物、過20目標準篩（≤0.85 mm），儲存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總DNA提取與高通量測序

稱取0.5 g新鮮土樣，采用E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Biotek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤微生物的總DNA，然后采用 Power Clean?DNA Clean-up Kit（MoBio，CA，USA）對提取的DNA進行純化，DNA濃度和純度利用 NanoDrop2000（Thermo，USA）進行檢測，再利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，最后放置–20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。對每份樣品，采用引物ITS3F/ITS4R（ITS3F∶5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′，ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增ITS片段[21]，PCR步驟按試劑盒說明書進行操作。使用2% 瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union-City CA，USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用Quanti-Fluor?-ST（Promega，USA）對PCR產物進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE2*300的文庫。構建文庫步驟：連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴增進行文庫模板的富集；氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。原始數據上傳至NCBI數據庫中。

1.4 數據處理及生物信息學分析

數據下機后，使用Trimmomatic軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接：設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質控后長度低于50 bp的序列；barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基；根據重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。

使用UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據97% 的相似度對序列進行分類單元（operational taxonomic units,OUT）聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Unite ITS 8.0數據庫，設置比對閾值為70%。使用I-sanger生信云系統(tǒng)，計算各樣本（組）共有或特有的OTU數量與α多樣性指數；基于UniFrac距離算法NMDS（non-metric multidimensional scaling）和ANOSIM（analysis of similarities）對各種長勢古樹名木根際土壤的真菌群落組成及β多樣性進行分析，通過對樣本（組）間距離判斷其差異大小；設置LDA（linear discriminant analysis）score的閾值為2，對各種長勢組的差異真菌進行分析，找出不同長勢中具有顯著性差異的真菌物種。本研究運用SPSS 24.0中單因素方差分析法判斷古樹名木不同長勢對其土壤真菌α多樣性指數的影響，運用最小顯著差異法（LSD）（P＜0.05）進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 古樹名木長勢

經過長勢評價，正常組為48株，占總株數64.0%，其中古樹46株，名木2株；衰弱組為22株，占總株數29.3%；瀕危組為5株，占總株數6.7%。正常組古樹名木長勢較好，典型的癥狀出現在樹冠，異常葉片平均比例為15.3%，枯枝平均比例為7.5%，偶見枯枝掉落。衰弱組古樹出現一定范圍的損傷，異常葉片平均比例為43.8%，枯枝平均比例為27.5%，樹冠某處集中出現枯枝，樹干有明顯空洞。瀕危組古樹損傷嚴重，異常葉片平均比例為81.4%，枯枝平均比例為72.8%，樹木衰變，木材形成層活動減慢，樹冠稀疏，枯枝較多。

2.2 土樣測序結果

通過對古樹名木根際土壤真菌的ITS鑒定，75個土壤樣品一共獲得5 092 652條高品質序列。供試土樣序列經過OTU聚類處理，3個長勢組共有11 293個OTUs。所有土樣的稀釋曲線隨有效序列數目增加而逐漸平緩（圖1），說明本次取樣基本能反映真實環(huán)境，3個長勢組土壤真菌群落情況置信度較高。由圖2a的Venn圖可以看出，不同長勢古樹名木根際土壤中真菌OTU數目中，ZC獲得的OTU數目最多（9 486），其次是SR（6 911），BW最低（2 982）。3個長勢組土壤共有的OTU數目較多（2 195），同時在綱水平的Venn圖顯示（圖2b），3個長勢組樣點共有真菌45綱。

2.3 3種長勢古樹名木土壤真菌群落組成及物種差異

3種長勢75個土樣的OTU有效序列經分析鑒定出17門、67綱、176目、418科、1 078屬、2 101種的真菌學名。由圖3可知，3個長勢組土壤真菌群落門水平上主要屬于9個類群，主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、分類地位未鑒定真菌（unclassified_k_Fungi）、被孢霉門（Mortierellomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、梳霉門（Kickxellomycota）和捕蟲霉門（Zoopagomycota）。

圖1 3個長勢組土樣稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of soil sample in 3 growing groups

圖2 3個長勢組土壤真菌韋恩圖Fig.2 Venn diagram of soil fungi in 3 growing groups

圖3 3種長勢古樹名木土壤真菌門水平上的群落豐度Fig.3 Community abundance at the level of phylum of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees

由圖4可知，3個長勢組土壤真菌群落綱水平上主要屬于12個類群，主要包括糞殼菌綱（Sordariomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、分類地位未鑒定真菌（unclassified_k_Fungi）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、分類地位未鑒定子囊菌門真菌（unclassified_p_Ascomycota）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）、分類地位未鑒定羅茲菌門真菌（unclassified_p_Rozellomycota）、分類地位未鑒定羅茲菌亞門真菌（Rozellomycotina_cls_incertae_sedis）、盤菌綱（Pezizomycetes）和錘舌菌綱（Leotiomycetes）。

圖4 3種長勢古樹名木土壤真菌綱水平上的群落豐度Fig.4 Community abundance at the level of class of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees

在屬分類水平上，忽略相對豐度小于1%的菌屬不計，3種長勢的古樹名木根際土壤真菌共有35屬（圖5）；各個長勢組均含有相當一部分真菌未被分類，相對豐度在25%～35%。

圖5 3 種長勢古樹名木土壤真菌屬水平上的群落豐度Fig.5 Community abundance at the level of genus of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees

根據LEfSe分析的LDA判別分值，由表2可知，在綱分類水平上，BW組土壤中糞殼菌綱與其他2個長勢組差異顯著。3個長勢組有顯著差異的真菌屬總計36個，其中BW組古樹名木土壤中差異顯著的真菌屬最多，共28個；ZC組與SR組有顯著差異的真菌屬數量相同，各有4個。

表2 3種長勢古樹名木土壤真菌門和屬的LDA分值（差異顯著）Table 2 LDA scores of soil fungi of 3 species of ancient and famous trees (significant difference)

2.4 3種長勢古樹名木土壤真菌群落多樣性分析

2.4.1 α多樣性分析

通過采用Chao1算法和Ace算法估算群落中OTU數目，反映土壤真菌群落物種豐富度；采用Shannon指數和Simpson指數說明土壤真菌群落的多樣性。由表3可知，Chao指數和Ace指數由大到小排列依次為：SR＞BW＞ZC，其中SR的Ace指數與ZC差異顯著（P＜0.05）。各長勢組的香農指數由大到小排列依次為：BW＞SR＞ZC，辛普森指數排序為：SR＞ZC＞BW，但差異均不顯著。

表3 不同長勢古樹名木土壤真菌生境內多樣性指數（α多樣性指數）Table 3 Soil fungi within-habitat diversity index of ancient and famous trees with different growth potentials (α diversity index)

2.4.2 β多樣性分析

基于unweighted UniFrac距離算法，對3種長勢古樹名木土壤真菌群落OTU進行非度量多維尺度分析（NMDS分析），結果見圖6。3個長勢組的土壤真菌群落距離較近，ZC組范圍最大，基本包含其他2組的真菌群落，范圍大小關系為：ZC＞SR＞BW。為了檢驗群落組成結構差異的顯著性，進行組間相似性分析（ANOSIM），結果表明3種長勢古樹名木土壤真菌群落OTU組成相似，且差異不顯著（R=-0.081，P=0.889）。

圖6 3種長勢古樹名木土壤真菌群落基于unweighted UniFrac距離的非度量多維尺度分析Fig.6 Non-metric multi-dimensional scale analysis of soil fungal communities of 3 species of ancient and famous trees based on unweighted UniFrac distance

3 結論與討論

Illumina MiSeq高通量測序技術的發(fā)展為快速有效分析微生物群落結構和組成提供了一個強大而高效的平臺[22]。部分學者指出，在不同的生境中，微生物群落的總體組成或許存在較大差異，但優(yōu)勢菌群基本相似[17]。結果表明：子囊菌門和擔子菌門是3種長勢古樹名木土壤真菌的優(yōu)勢菌門，其含量均高于70%。這2類菌在3個長勢組中豐度各異，其中子囊菌門在瀕危組中的相對豐度最高，正常組次之，衰弱組最低，在各組的含量分別為71.38%、59.68%及59.20%；擔子菌門在衰弱組的相對豐度最高，正常組次之，瀕危組最低，在各組的含量分別為26.15%、23.42%及17.01%。熊丹等[23]利用第2代基因測序技術（Illumina平臺）對貴陽市3個地區(qū)的馬尾松-杜鵑群落中杜鵑根圍土壤真菌群落分析，結果在調查區(qū)域中一共發(fā)現土壤真菌9門296屬，其中相對豐度最高的是子囊菌門和擔子菌門，這與本研究結果相一致。按屬水平分類，3種長勢古樹名木根際土壤中均含有部分真菌未被分類，在已分類的真菌屬中，豐富度由至高低排序分別為Saitozyma、曲霉屬（Aspergillus）、毛殼菌屬（Chaetomium）、被孢霉屬（Mortierella）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、靈芝屬（Ganoderma）、青霉屬（Penicillium）、Apiotrichum、新赤殼屬（Neocosmospora）等，其中以Saitozyma、曲霉屬、毛殼菌屬、被孢霉屬、毛孢子菌屬、靈芝屬和青霉屬為優(yōu)勢菌屬。部分優(yōu)勢菌屬與相關研究結果一致，如董愛榮等[24]對紅松（Pinus koraiensis）林土壤真菌多樣性的研究指出，小興安嶺地區(qū)土壤真菌的優(yōu)勢屬為接合菌綱的被孢霉屬、子囊菌綱的青霉屬以及絲孢綱的木霉屬和輪枝孢屬（Verticilium）。賈麗等[25]對天水小隴山白皮松（Pinus bungeana）林的土壤真菌多樣性的研究表明，真菌的多樣性指數在不同樣地差異較大，優(yōu)勢菌群為子囊菌綱的青霉屬和子囊菌綱曲霉屬。

本研究對3個長勢組古樹名木根際土壤真菌生境內多樣性（α指數）分析可知，受損古樹名木（衰弱組和瀕危組）根際土壤真菌群落豐度指數（Ace和Chao指數）大于健康的古樹名木（正常組）。不同的森林類型或植物種類[26]，其土壤微環(huán)境[27]或地表枯落物可利用率各異[28]，從而影響土壤真菌群落組成結構。通過改變土壤環(huán)境[29]，植物使土壤微生物的群落結構發(fā)生分異，影響其物種多樣性[17,30]。對3種長勢古樹名木根際土壤真菌進行群落組成與多樣性分析，可以為古樹名木的管護和人工復壯提供科學依據。此外，3個長勢組土壤高通量測序結果顯示有大量真菌ITS序列未被鑒定，這些未知菌株尚待下一步的分析。

由結果可知，東莞市古樹名木大部分都有一定程度損傷，但總體長勢良好。3種長勢古樹名木根際土壤真菌群落以糞殼菌、傘菌和散囊菌3個菌綱為優(yōu)勢菌。結合土壤真菌OTU豐度與物種系統(tǒng)發(fā)育距離矩陣分析，3種長勢古樹名木土壤真菌群落組成無明顯差異。正常長勢組古樹名木長勢優(yōu)于衰弱長勢組和瀕危長勢組，導致土壤真菌群落豐富度低于衰弱長勢組和瀕危長勢組，古樹名木的長勢及健康狀況對其土壤真菌群落組成有一定影響。