兩種造模方法致大鼠慢性腎病模型的腎功能及病理變化比較

李天祎 楊 揚(yáng) 楊素萍 李嘉琦 馬逸群 王家平

慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)是影響全球公共健康的主要疾病之一，全球發(fā)生率約為8%～16%[1]。臨床多表現(xiàn)為蛋白尿、低蛋白血癥、水腫以及高脂血癥等。因CKD發(fā)生率逐漸增高，病程遷延，很難治愈，末期多發(fā)展為慢性腎衰竭，只能依靠透析、換腎等僅有的治療方式緩解，已經(jīng)逐漸成為威脅人類(lèi)健康的一類(lèi)慢性疾病。隨著人們對(duì)慢性腎病發(fā)病機(jī)制和病理變化等研究的深入，建立慢性腎病動(dòng)物模型對(duì)研究CKD的腎組織病理形態(tài)學(xué)變化以及探究治療CKD的新方法有著重要的意義。

目前，國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的模擬慢性腎病效果較好的為阿霉素(adriamycin，ADR)大鼠模型。ADR在大鼠體內(nèi)代謝較為緩慢，對(duì)心臟、肝臟、骨髓、胃腸等具有較強(qiáng)的不良反應(yīng)，但經(jīng)尾靜脈注射后，其毒性可主要積累于腎臟[2]。因此，應(yīng)用ADR造模時(shí)，應(yīng)注意注射的方式、劑量等。近年來(lái)，應(yīng)用較為廣泛的方法主要有尾靜脈注射法(單次或多次)、單側(cè)腎切除+重復(fù)尾靜脈注射ADR和腎動(dòng)脈注射法等。本研究比較單側(cè)腎切除+重復(fù)尾靜脈注射ADR及二次尾靜脈注射ADR這兩種方法，旨在為更好地復(fù)制慢性腎病模型提供更加豐富的參考依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠，18只，體質(zhì)量150～200g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保證動(dòng)物在室溫下正常飼養(yǎng)。(2)主要試劑：阿霉素(ADR)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，醫(yī)用縫線、一次性無(wú)菌巾、75%乙醇、醫(yī)用紗布等購(gòu)自杭州華威醫(yī)療用品。

2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)大鼠造模：將18只SD大鼠隨機(jī)分為3組，即N組、A組和B組。N組為正常對(duì)照組(n=6)。A組為單側(cè)腎臟切除+重復(fù)尾靜脈注射ADR(n=6)，將大鼠10%水合氯醛麻醉后，取俯臥位固定于超凈臺(tái)，選取左側(cè)肋嵴角為手術(shù)切口，逐層剝離皮膚、皮下脂肪及肌肉組織后，將左側(cè)腎蒂剝離，用手術(shù)縫線進(jìn)行結(jié)扎，切除腎臟，縫合手術(shù)切口后消毒，術(shù)后以3mg/kg阿霉素經(jīng)大鼠尾靜脈注射，將大鼠歸籠正常飼養(yǎng)，并于14天后再次尾靜脈注射ADR(3mg/kg)1次。B組以3mg/kg ADR分兩次經(jīng)尾靜脈注射(n=6)，兩次間隔14天注射。

3.觀察指標(biāo)：(1)一般情況：觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛色、體質(zhì)量變化等一般情況，有無(wú)水腫，腹腔積液或癱瘓等。(2)大鼠腎功能檢測(cè)：注射后第4、8、12周，將大鼠用乙醚麻醉后采用內(nèi)眥采血法，3000r/min離心20min，分離血清。日本日立7170A型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血尿素氮、血肌酐、血清白蛋白，各組標(biāo)本均在筆者醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。(3)腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察：于第12周末處死各組大鼠，取出右腎，快速剝離腎包膜，放置在10%甲醛溶液中固定，脫水、透明、石蠟包埋后，切片(厚約3μm)，作蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察并攝片。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用IBM SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.一般情況：N組大鼠活動(dòng)靈便，狀態(tài)良好，毛色順滑。A、B組兩組大鼠狀態(tài)較差，部分大鼠伴有毛發(fā)脫落，活躍欠佳，飲食量有不同程度減少，均出現(xiàn)不同程度水腫，毛色黯淡、微黃，精神不振，部分大鼠伴有腹腔積液，其中A組比B組變化更為明顯。

2.各組腎功能變化：與N組比較，A、B兩組大鼠血肌酐、血尿素氮升高，并表現(xiàn)為低蛋白血癥。血尿素氮(BUN)值：8、12周末，A組尿素氮即出現(xiàn)上升(P<0.05)，B組在12周末尿素氮上升較為明顯(P<0.05)；血肌酐(Cr)值：A、B組血肌酐在8周末及12周末較4周時(shí)均有明顯上升(P<0.05)；白蛋白值：A、B組較N組均有降低，在8周時(shí)A組下降較為明顯(P<0.05，表1，圖1)。

表1 各組大鼠腎功能及白蛋白比較

圖1 各組大鼠腎功能及白蛋白比較與A組比較，*P<0.05

3.腎組織病理學(xué)改變：肉眼觀察：12周末A組腎臟體積明顯增大，表面凹凸不平，呈彌漫性顆粒狀改變，色澤呈黃褐色改變；B組腎臟包膜緊張，表面尚光滑，色偏黃褐。光鏡下觀察：N組大鼠的腎小球、腎小管和腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常改變；A組腎臟的腎小球出現(xiàn)萎縮，硬化，局部腎小球毛細(xì)血管袢擴(kuò)張淤血，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣變性，腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，并且腎間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，受損程度和灶性病變范圍較B組加重；B組大鼠的腎組織切片顯示，腎臟近曲、遠(yuǎn)曲小管、髓袢和集合管上皮可見(jiàn)不同程度水腫變性，部分管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)可見(jiàn)少量透明管型，部分腎小球有輕微的萎縮，腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量輕-中度淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)的炎性反應(yīng)(圖2)。

圖2 各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果(×20)A.N組；B.A組；C.B組

討 論

阿霉素(ADR)，又名多柔比星，做為一種蒽環(huán)類(lèi)抗生素，在臨床中廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療[3]。其導(dǎo)致腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制主要有3個(gè)方面：①ADR抑制大鼠腎臟的自噬過(guò)程，造成肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架損傷，足細(xì)胞足突消失[4]；②ADR可以誘導(dǎo)腎小球上皮細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)，造成腎小球?yàn)V過(guò)膜完整性被破壞，導(dǎo)致濾過(guò)屏障受損而形成持續(xù)蛋白尿；③ADR能激活多種炎性介質(zhì)，促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖，隨著病程遷延逐漸發(fā)展導(dǎo)致腎小球硬化[5]。全球首次報(bào)道阿霉素腎病在20世紀(jì)80年代初，近年來(lái)，在使用阿霉素造模過(guò)程中，對(duì)于用法與用量仍存在分歧和爭(zhēng)議。因較大劑量會(huì)使大鼠出現(xiàn)心力衰竭、免疫力下降甚至死亡，而減少劑量則使造模時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠腎臟損傷達(dá)不到造模標(biāo)準(zhǔn)，所以對(duì)于阿霉素的應(yīng)用劑量和造模方法目前仍然無(wú)法統(tǒng)一[6]。

目前，較為常用的慢性腎病模型制作方法主要有以下5種：①5/6腎切除[7]；②尾靜脈注射阿霉素；③單側(cè)腎切除+尾靜脈注射阿霉素[8,9]；④尾靜脈注射環(huán)孢素；⑤結(jié)扎單側(cè)輸尿管等方法[10]。研究報(bào)道，尾靜脈注射ADR法，首次劑量過(guò)大易出現(xiàn)大鼠極度狂躁、死亡等情況，尾靜脈注射次數(shù)過(guò)多可能出現(xiàn)阿霉素外滲，造成劑量不足或大鼠尾部潰爛等情況發(fā)生[11]。單側(cè)結(jié)扎大鼠輸尿管的方法在制作模型時(shí)，因需要把腎盂輸尿管結(jié)合部和輸尿管膀胱入口處一并結(jié)扎，所以手術(shù)切口較大，并且找尋輸尿管所需時(shí)間較長(zhǎng)，故造成的手術(shù)不良反應(yīng)較大，且具有易感染等缺陷；5/6腎切除法對(duì)于術(shù)者要求較高，手術(shù)切面過(guò)大，出血量也隨之增大，病死率較高[12]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究并對(duì)比上述造模方法，單側(cè)腎臟切除+二次尾靜脈注射ADR法具有以下優(yōu)勢(shì)：①手術(shù)切口較小，可直接結(jié)扎單側(cè)腎蒂，出血量較小，手術(shù)時(shí)間縮短，可降低大鼠的感染概率，病死率較??；②單側(cè)腎臟切除后阿霉素給藥劑量較單次尾靜脈注射ADR法小，可降低阿霉素外滲可能，減輕大鼠尾部潰爛；③大鼠造模后，成模所需時(shí)間較二次尾靜脈注射ADR法更短，且成模效果較好。

本研究比較的兩種方法均可制作阿霉素腎病模型。單側(cè)腎臟切除+重復(fù)尾靜脈注射ADR和兩次尾靜脈注射ADR法均可使大鼠腎功能發(fā)生改變。在各個(gè)觀察點(diǎn)A、B兩組的血肌酐、血尿素氮值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與此同時(shí)，兩組的腎組織也具有顯著的形態(tài)學(xué)變化。其中A組血肌酐、血尿素氮在第8周時(shí)即出現(xiàn)上升，白蛋白也在8周末出現(xiàn)明顯下降，且A組大鼠腎臟病理切片顯示腎小球出現(xiàn)萎縮，硬化，球囊粘連，局部腎小球毛細(xì)血管袢擴(kuò)張淤血，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣變性，腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，并且腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。這一結(jié)果提示單側(cè)腎切除+重復(fù)尾靜脈注射阿霉素法發(fā)展為慢性腎衰竭的趨勢(shì)更加明顯。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與單側(cè)腎臟的負(fù)荷加重導(dǎo)致代償功能不足，呈現(xiàn)出腎功能進(jìn)行性加重，故而更加符合慢性腎衰竭的表現(xiàn)，其腎臟的病理學(xué)改變也證明了這一點(diǎn)[13]。

近年來(lái)，阿霉素大鼠模型因其能更好地復(fù)制人類(lèi)慢性腎病表現(xiàn)而得到了廣泛的研究與應(yīng)用，ADR可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮變薄和足細(xì)胞消失，這與血漿蛋白過(guò)濾的大小和電荷特異性屏障的喪失有關(guān)[14]。其動(dòng)物模型的組織學(xué)變化與人類(lèi)局灶性腎小球硬化相似，伴有足細(xì)胞融合、局灶節(jié)段性和腎小球硬化以及腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化，并且大鼠表現(xiàn)出來(lái)的血清肌酐升高、肌酐清除率降低、血清白蛋白降低、血脂異常和尿蛋白排泄增加，與腎病綜合征和CKD一致[15]。本研究的不足之處在于觀察時(shí)間僅到12周，無(wú)法觀察12周之后的腎功能變化趨勢(shì)，除此之外在應(yīng)用阿霉素過(guò)程中，由于實(shí)驗(yàn)大鼠的批次、藥物敏感度和遺傳變異等方面會(huì)對(duì)大鼠的腎功能產(chǎn)生一定的影響，因此如何使大鼠腎臟損傷趨于穩(wěn)定還需進(jìn)一步研究。