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    正交設(shè)計(jì)優(yōu)選百蕊草的提取工藝研究

    2021-01-11 09:25:18鮑玲玲陳乃東
    關(guān)鍵詞:葡萄糖多糖功率

    鮑玲玲, 陳乃東

    (皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237001)

    百蕊草又被稱(chēng)作小草、青龍草、百乳草、地石榴等,是檀香科植物百蕊草(ThesiumChinenseTurcz.)的干燥全草。 百蕊草性寒而平緩,味辛微苦,歸肺、脾、腎經(jīng),主要治療的病癥為腎虛腰痛、癤腫、急性乳腺炎、咽炎、感冒發(fā)熱、上呼吸道感染、各種感染等。百蕊草具有清熱解毒、補(bǔ)腎澀精、消炎、鎮(zhèn)痛的功效,是一種療效較好的廣譜的抗菌中草藥[1-2]。根據(jù)百蕊草具有的功效和作用可知,它所具有臨床用藥的需求日益得到發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)以百蕊草總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為最終指標(biāo),以單因素實(shí)驗(yàn)為前提作為基礎(chǔ),再用超聲波來(lái)輔助提取,對(duì)百蕊草的提取工藝進(jìn)行探討和研究,目的是為百蕊草的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。因此,優(yōu)選百蕊草多糖的超聲波提取工藝,提高百蕊草的有效價(jià)值的利用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,為百蕊草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 供試材料

    FA1004型電子分析天平(中國(guó)上海精科有限公司);TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(深圳億鑫儀器設(shè)備有限公司)。硫酸(分析純,華富化工有限公司);蒽酮(分析純,華富化工有限公司);百蕊草(ThesiumChinenseTurcz.),全草(2019年9月購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)),由皖西學(xué)院生物與制藥工程陳乃東教授鑒定為正品。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 糖類(lèi)化合物處理

    1.2.1.1 樣品處理 稱(chēng)取100 g干百蕊草剪碎,用研缽研碎成粉末,漂洗后進(jìn)行冷凍干燥,過(guò)250 μm篩后收集粉末于烘箱中105 ℃烘至恒重。

    1.2.1.2 脫脂和浸提 精密稱(chēng)取2.0 g的百蕊草原粉末,在超聲功率 80 W,料液比為1∶55 的條件下,超聲處理 50 min。收集脫脂后的粗多糖提取液[3]。

    1.2.2 百蕊草多糖測(cè)定及方法 用Molish反應(yīng)作為多糖的鑒定反應(yīng)。

    1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 分別精密量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,再分別加水到1.0 mL,搖勻,在準(zhǔn)備好的冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL,搖勻,冷卻后,放置沸水浴中保溫10.0 min后取出,再在冰水浴中冷卻10.0 min,在490 nm下測(cè)吸光度[4]。

    1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取2.0 g干燥至恒重的百蕊草原粉末若干份,按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),依次考察超聲功率、料液比、超聲時(shí)間對(duì)百蕊草多糖提取物的影響。

    1.2.5 提取工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇合適的因素水平,設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),得出百蕊草多糖最有效提取工藝條件[5]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總多糖提取工藝條件測(cè)定結(jié)果

    2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 由表1和圖1可知,建立的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線符合線性關(guān)系。

    表1 葡萄糖濃度與吸光度關(guān)系

    2.1.2 超聲功率對(duì)總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 料液比為1∶35 (g/mL),超聲時(shí)間為50 min,在這樣的條件下,研究超聲功率對(duì)總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響(圖2)。由于超聲的功率的增大,總多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也會(huì)隨著超聲的功率的升高而增大,當(dāng)超聲的功率達(dá)到80 W時(shí)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也達(dá)到最大,但也有圖可知,在60~80 W時(shí)隨著功率的增大,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升的趨勢(shì)也漸漸趨于平緩的狀態(tài)。這是由于百蕊草多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少,內(nèi)外滲透壓達(dá)到平衡,提取率趨于穩(wěn)定。因此,百蕊草多糖提取的超聲波功率需控制在80 W左右為宜。

    圖1 萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

    圖2 超聲功率對(duì)百蕊草多糖提取的影響

    2.1.3 料液比對(duì)總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 把超聲功率定為60 W、超聲時(shí)間設(shè)為50 min,在這樣的條件下,探討料液比對(duì)總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響,見(jiàn)圖3。由于料液比的變大,總多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨它的變大而升高。當(dāng)料液比為1∶55時(shí),此時(shí)多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也達(dá)到最大,但料液比超過(guò)1∶55 min時(shí),多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有減緩的趨勢(shì),考慮到后期耗費(fèi)的試劑增多,后處理工作量增大。綜合考慮,料液比1∶35~1∶55作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的料液比考察范圍[4]。

    2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 把超聲功率設(shè)為60 W,料液比定為1∶35 (g/mL),在這樣的條件下,研究超聲時(shí)間對(duì)百蕊草多糖的影響,見(jiàn)圖4。由于超聲的時(shí)間的增大,總多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨它的增大而變大。當(dāng)超聲的時(shí)間設(shè)為90 min時(shí),總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大。在超聲時(shí)間為50 min時(shí),隨著超聲時(shí)間的增加,總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)已經(jīng)趨于平穩(wěn)狀態(tài),故選擇30、50、70 min這個(gè)時(shí)間段為進(jìn)一步優(yōu)化提取時(shí)間的范圍。[5]

    圖3 料液比對(duì)百蕊草總多糖提取的影響

    圖4 超聲時(shí)間對(duì)百蕊草總多糖提取的影響

    2.1.5 提取工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所得出的結(jié)果,選擇每個(gè)因素的3個(gè)水平(表3),以 L9(33) 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[6]。

    表1 因素水平表

    表2 正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

    表3 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)方差分析結(jié)果

    所得出的正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1~3所示,在影響總多糖提取的3個(gè)因素中,對(duì)總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響依次為:料液比(Y)>超聲功率(X)>超聲時(shí)間(Z),最有效的百蕊草多糖提取工藝條件為X3、Y3、Z2。從方差分析來(lái)看,超聲功率、超聲時(shí)間、料液比均有顯著性影響,最佳提取工藝為超聲功率80 W,料液比為1∶55,超聲的時(shí)間為50 min。

    2.2 方法評(píng)價(jià)

    2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取1份1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,按照1.3.3節(jié)的方法,測(cè)定吸光度,平行測(cè)定5次,測(cè)得吸光度的RSD為0.79%,表明該測(cè)定方法及儀器精密度良好[7]。

    2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 同一樣品溶液,每隔10 min測(cè)1次,連續(xù)測(cè)定3 h,其RSD為0.75%,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中多糖測(cè)定方法穩(wěn)定性良好[8]。

    2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6 份2.0 g 百蕊草粉末,按1.3.2節(jié)設(shè)定的方法測(cè)定,RSD為1.78%,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的方法重復(fù)性良好。

    2.2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 取6份2.0 g百蕊草粉末分別加入不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,按1.3.2節(jié)設(shè)定的方法測(cè)定,葡萄糖的回收率為101.8%±4.27%。

    2.3 百蕊草總多糖的測(cè)定

    根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y=11.91x-0.132 4,R2=0.997 9.其中y代表吸光度,x代表濃度,最有效的提取工藝,即在料液比1∶55 (g/mL),超聲的功率為80 W,超聲的時(shí)間為50 min,提取總多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,得到百蕊草多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.04%。

    3 結(jié)論與討論

    超聲可以在介質(zhì)中產(chǎn)生一種效應(yīng)(即超聲可以在介質(zhì)中傳播原因是由反射而產(chǎn)生的一種機(jī)械效應(yīng))它可以引起機(jī)體的若干反應(yīng)[9-10]。由于超聲的這種效應(yīng),可以使細(xì)胞產(chǎn)生震蕩、摩擦、旋轉(zhuǎn)等現(xiàn)象,正因?yàn)槌暰哂羞@種特性,它可以改變細(xì)胞膜的通透性。此實(shí)驗(yàn)就是利用超聲的這種特性,進(jìn)行百蕊草中多糖的提取,利用超聲波分散破壞植物組織,加速溶劑穿透組織作用,提高百蕊草有效成分的提取[11-12]。但超聲也有它不利的方面,比如隨著超聲的功率的增大,超聲的時(shí)間的加長(zhǎng),它會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),使細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致細(xì)胞破裂,使百蕊草多糖提取降低,也會(huì)產(chǎn)生溫?zé)嵝?yīng),導(dǎo)致溶劑溫度升高。多糖的測(cè)定方法主要有苯酚-硫酸法[13]、蒽酮-硫酸法、DNS法等[14]。多糖的測(cè)定應(yīng)該選取合適的單糖作為對(duì)照;苯酚-硫酸法具有靈敏、受蛋白質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn),蒽酮-硫酸法需要有合適的對(duì)照品為前提,DNS法以不同標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照差異小而優(yōu)[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)百蕊草的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行探討和研究,目的為百蕊草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究奠定基礎(chǔ)。因此,優(yōu)化百蕊草多糖的超聲波提取工藝,將大大提高百蕊草的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對(duì)于百蕊草中的多糖組分的分析是其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系研究的一項(xiàng)基本且重要的內(nèi)容。對(duì)于以后深入探究百蕊草多糖活性組分的研究具有重要的影響。

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