小麥和大麥麩質(zhì)蛋白的提取方法比較及SDS-PAGE分析

汪佳佳 胡慧敏 潘雪峰 陳霞 莊昕波 張濤 陳銀基

摘要：以小麥和大麥為材料，分別采用混合物提取法、乙醇提取法、異丙醇結(jié)合DTT提取法、異丙醇結(jié)合DTT兩步提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法及水—氯化鈉—乙醇水浴提取法對(duì)小麥和大麥進(jìn)行麩質(zhì)蛋白提取，比較不同方法提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE分析比較其蛋白組成的差異。結(jié)果顯示，除水—氯化鈉—乙醇提取法不能完整提取小麥麩質(zhì)蛋白，其余幾種方法均成功提取麩質(zhì)蛋白?；旌衔锾崛》ā?0%乙醇提取法、異丙醇結(jié)合DTT提取法、70%乙醇提取法從大麥中提取的麩質(zhì)蛋白質(zhì)量濃度較高。混合物提取法提取液中SDS-PAGE條帶數(shù)最多，并且可以提取高分子量麥谷蛋白。

關(guān)鍵詞：小麥；大麥；麩質(zhì)蛋白；提??；SDS-PAGE

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210224

小麥和大麥?zhǔn)敲媸车闹饕獊?lái)源，也是必需氨基酸及許多生物活性成分的潛在來(lái)源[1-2]，其麩質(zhì)蛋白主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，是麥類中的貯藏蛋白，約占麥類蛋白的80%[3]。當(dāng)麩質(zhì)蛋白與水混合時(shí)，麥醇溶蛋白通過(guò)形成分子內(nèi)二硫鍵賦予面團(tuán)延展性，麥谷蛋白通過(guò)形成分子間二硫鍵賦予面團(tuán)黏彈性，二者的組成和結(jié)構(gòu)會(huì)影響面團(tuán)的形成及其制品烘焙品質(zhì)。麩質(zhì)蛋白是引起乳糜瀉的主要因素，研究[4]表明，麥醇溶蛋白中含有豐富的脯氨酸和谷氨酰胺，是麩質(zhì)蛋白中最主要的抗原成分，能夠觸發(fā)免疫反應(yīng)，其中包含刺激性表位最多的是α-/β-醇溶蛋白，能夠觸發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致乳糜瀉。

乳糜瀉（Celiac disease）是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性小腸炎癥性疾病，由基因易感個(gè)體攝入小麥和大麥中的麩質(zhì)蛋白引起[5]。乳糜瀉是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，遺傳因素主要包括人類白細(xì)胞抗原HLA-DQ2和HLA-DQ8，環(huán)境因素主要包括麩質(zhì)蛋白上的T細(xì)胞表位和麩質(zhì)蛋白中富含的脯氨酸[6]。根據(jù)血清學(xué)和活檢，估計(jì)全球乳糜瀉的平均患病率分別為1.4%和0.7%，但區(qū)域差異較大[7]?；颊呓K生嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)麩質(zhì)飲食是目前治療乳糜瀉的唯一可靠方法。因此，探索和篩選高效的麩質(zhì)蛋白提取方法對(duì)小麥和大麥麩質(zhì)蛋白檢測(cè)與應(yīng)用具有重要意義。

本研究選取混合物提取法[8]、60%乙醇提取法[9]、異丙醇結(jié)合DTT提取法[10]、異丙醇結(jié)合DTT兩步提取法[11]、70%乙醇提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法[12]等麩質(zhì)蛋白提取具有代表性的方法以及在三步提取法基礎(chǔ)上改進(jìn)的水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法對(duì)小麥麩質(zhì)蛋白進(jìn)行提取，并對(duì)提取液進(jìn)行SDS-PAGE分析，以期篩選高效適宜的麩質(zhì)蛋白提取方法，為麩質(zhì)蛋白檢測(cè)工作及無(wú)麩質(zhì)食品研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥（過(guò)60目篩）：產(chǎn)自河南商丘；大麥（過(guò)60目篩）：產(chǎn)自吉林通化；Cocktail提取液：德國(guó)拜發(fā)公司；無(wú)水乙醇（分析純）：無(wú)錫市亞盛化工有限公司；異丙醇（分析純）、鹽酸（分析純）、丙酮（分析純）：南京化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）、冰醋酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BSA標(biāo)準(zhǔn)品5×G250染色液、DTT（分析純）、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、PBS稀釋液、5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)R250、TEMED：北京索萊寶科技有限公司；AP（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 主要儀器

THZ-82恒溫振蕩器：國(guó)華電器有限公司；DHG-90338S-Ⅲ型烘箱：中國(guó)上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；vortex_genie 2型渦旋混合器：美國(guó)Scientific Industries公司；TWS-24型四孔恒溫水浴鍋：上海喆圖科學(xué)儀器有限公司；TG16WS型高速臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；SpectraMax 190型酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；Mini-PROTEAN型電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 麩質(zhì)蛋白的提取

1.3.1 混合物提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL Cocktail提取液，渦旋混勻，于50 ℃孵育40 min。冷卻樣品，然后加入3 mL 80%乙醇，室溫條件下振蕩1 h。5 000 r/min離心10 min，收集上清液（樣品A）。

1.3.2 乙醇提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL 60%或70%的乙醇溶液，渦旋混勻，振蕩提取2 h，7 000 r/min離心10 min，收集上清液。分別將60%和70%乙醇提取的樣品編號(hào)為B和C。

1.3.3 異丙醇結(jié)合DTT提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL 50%異丙醇—1% DTT—50 mmoL/L Tris-HCl （pH 7.5），渦旋混勻，振蕩提取2 h，7 000 r/min離心10 min，收集上清液（樣品D）。

1.3.4 異丙醇結(jié)合DTT兩步提取法

稱取0.1 g樣品，加入50%異丙醇，渦旋混勻，超聲10 min，回旋振蕩30 min，7 000 r/min離心10 min，收集上清液1；向沉淀加入1 mL 50%異丙醇—1% DTT—50 mmoL/L Tris-HCl （pH 7.5），超聲10 min，60 ℃加熱30 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，收集上清液2，沉淀再次用1 mL 50%異丙醇—1% DTT—50 mmoL/L Tris-HCl（pH 7.5）提取，步驟同上，得上清液3，合并3次上清液（樣品E）。

1.3.5 水—氯化鈉—乙醇三步提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL蒸餾水，振蕩提取30 min，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL 0.5 mol/L的NaCl溶液，振蕩提取30 min，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇溶液，振蕩提取30 min，7 000 r/min離心10 min，收集上清液（樣品F）。

1.3.6 水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL蒸餾水，超聲10 min，于水浴中提取40 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL0.5mol/L的NaCl溶液，超聲10 min，于水浴中提取40 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇溶液，超聲10 min，于水浴中提取40 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，收集上清液。分別將40、50、60 ℃下水浴提取的樣品編號(hào)為G40、G50、G60。

以上方法提取的蛋白質(zhì)均置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 麩質(zhì)蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用Bradford法。取出冷凍保存的蛋白樣品，待其恢復(fù)至室溫，渦旋混勻，用PBS稀釋液將各樣品稀釋5倍，渦旋混勻；取BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，用PBS稀釋液稀釋至250 μL，使溶液最終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。取2 mL 5×G250染色液，加入8 mL超純水，混勻成1×G250染色液。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、2、4、6、8、12、16、20 μL分別加到96孔板中，加PBS稀釋液補(bǔ)足到20 μL；將各樣品加20 μL到96孔板中，每孔均做3組平行。每孔加入200 μL 1×G250染色液，室溫放置3 ～ 5 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定A595 nm值。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)量濃度。

1.5 SDS-PAGE電泳分析

取出冷凍保存的蛋白質(zhì)樣品，待其恢復(fù)至室溫，渦旋混勻，每個(gè)樣品加入4倍體積100%丙酮，-20 ℃冷凍過(guò)夜。第2天取出樣品，升溫至4 ℃，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀樣品在50 ℃烘箱中干燥。

向沉淀中加入200 μL稀釋后的1×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，取5 μL上樣。采用10%的分離膠和4%的濃縮膠，電泳條件為恒流電壓80 V。電泳完畢后，用10%三氯乙酸溶液固定15 min，固定后用考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)蛋白進(jìn)行染色過(guò)夜，脫色液脫色6 h，用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中數(shù)據(jù)用軟件SPSS 16.0進(jìn)行分析，采用ANOVA分析，并通過(guò)Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)提取液中麩質(zhì)蛋白質(zhì)量濃度的影響

不同提取方法提取小麥和大麥中麩質(zhì)蛋白的質(zhì)量濃度如表1所示。從表1可以看出，不同提取方法對(duì)同一種谷物麩質(zhì)蛋白提取效果不同，同種方法對(duì)不同谷物麩質(zhì)蛋白的提取效果有較大差異。混合物提取法、60%乙醇提取法、70%乙醇提取法和異丙醇結(jié)合DTT提取法提取大麥中麩質(zhì)蛋白的質(zhì)量濃度高于小麥中麩質(zhì)蛋白的質(zhì)量濃度；異丙醇結(jié)合DTT兩步提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法和水—氯化鈉—乙醇水浴提取法提取小麥中麩質(zhì)蛋白的質(zhì)量濃度顯著高于大麥中麩質(zhì)蛋白的質(zhì)量濃度。

不同提取方法提取小麥麩質(zhì)蛋白的結(jié)果顯示，60%乙醇提取與混合物提取法、異丙醇結(jié)合DTT提取法、異丙醇結(jié)合DTT兩步提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法及水—氯化鈉—乙醇水浴40 ℃提取的麩質(zhì)蛋白質(zhì)量濃度有顯著性差異（P<0.05）。水—氯化鈉—乙醇三步提取法和混合物提取法提取的麩質(zhì)蛋白質(zhì)量濃度較前面的幾種方法差，但是高于水—氯化鈉—乙醇三步水浴40 ℃提取和異丙醇結(jié)合DTT兩步提取法。異丙醇結(jié)合DTT提取法對(duì)小麥麩質(zhì)蛋白的提取效果最差。

不同提取方法提取大麥中麩質(zhì)蛋白的結(jié)果顯示，混合物提取法、60%乙醇提取、70%乙醇提取的麩質(zhì)蛋白質(zhì)量濃度無(wú)顯著性差異（P>0.05），但是與其他6種方法差異顯著（P<0.05）。水—氯化鈉—乙醇三步提取法效果較差，水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法中，40 ℃提取的麩質(zhì)蛋白質(zhì)量濃度最高，與小麥的恰好相反。

2.2 SDS-PAGE電泳分析

2.2.1 條帶數(shù)比較

采用ImageJ軟件分析得到的不同提取方法電泳條帶數(shù)如表2所示。從表2可以看出，混合物提取法和水—氯化鈉—乙醇三步提取法提取得到的小麥中麩質(zhì)蛋白條帶數(shù)較多，乙醇和異丙醇提取法得到的條帶數(shù)較少。對(duì)于大麥麩質(zhì)蛋白的提取，混合物提取法得到的條帶數(shù)最多，其他幾種方法差異不大。

2.2.2 圖譜分析

對(duì)不同提取方法提取的小麥和大麥麩質(zhì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖1所示。

從圖1（a）可以看出，大部分方法提取出來(lái)的高分子量麥谷蛋白為3個(gè)條帶。D、G40、G50、G60 4個(gè)樣品的條帶顏色較淺，可能是高分子質(zhì)量麥谷蛋白含量較低。水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法中不同水浴溫度所得條帶有所差異，其中50 ℃水浴得到的條帶顏色最深，40、60 ℃水浴得到的顏色較淺，可能是50 ℃條件下提取的高分子質(zhì)量麥谷蛋白含量最高。水—氯化鈉—乙醇三步提取法的樣品在80 ～ 130 kDa條帶缺失，可能是此樣品中的高分子質(zhì)量麥谷蛋白含量非常低。

分子量為50 ～ 70 kDa的區(qū)間主要分布的是ω-醇溶蛋白（50 ～ 70 kDa）和D-型低分子質(zhì)量麥谷蛋白（50 ～ 60 kDa），二者存在交叉，很難被清晰地區(qū)分開(kāi)。所有方法提取的蛋白在D-型低分子質(zhì)量麥谷蛋白區(qū)域存在條帶，但無(wú)分子質(zhì)量較高的ω-醇溶蛋白（60 ～ 70 kDa）。從整個(gè)ω-醇溶蛋白和D-型低分子質(zhì)量麥谷蛋白區(qū)域可知，幾種方法提得的蛋白質(zhì)差異性不大。

分子質(zhì)量為30 ～ 50 kDa的區(qū)間主要分布的是低分子質(zhì)量麥谷蛋白和α-，β-，γ-醇溶蛋白。其中B-型低分子質(zhì)量麥谷蛋白主要分布在40 ～ 50 kDa，C-型低分子質(zhì)量麥谷蛋白主要分布在30 ～ 40 kDa，α-，β-，γ-醇溶蛋白主要分布在30 ～ 45 kDa。由于低分子質(zhì)量麥谷蛋白和α-，β-，γ-醇溶蛋白的分子質(zhì)量區(qū)間存在交叉，因而想要嚴(yán)格地區(qū)分出各種蛋白，存在一定難度。從圖1可以看出，分子質(zhì)量在40 ～ 50 kDa蛋白差異較小，樣品B、C、E及G50的蛋白在30 ～ 40 kDa條帶顏色更深。

30 kDa以下區(qū)域，水—氯化鈉—乙醇三步提取法提得的蛋白條帶較少，顏色較淺，其余幾種方法條帶更多，顏色更深。有研究[13—14]證明，提取液中加入的還原劑會(huì)影響免疫反應(yīng)，但還原劑DTT或β-巰基乙醇能提高麥谷蛋白的提取效率，而混合物提取法所用的Cocktail提取液中β-巰基乙醇和胍氯化物以1∶100稀釋后不會(huì)影響免疫反應(yīng)。

從圖1（b）可以看出，混合物提取法對(duì)醇溶蛋白的提取效果較好，條帶清晰，除混合物提取法和異丙醇結(jié)合DTT兩步提取法提取出了高分子質(zhì)量谷蛋白外，其余幾種方法均未能提取，但對(duì)醇溶蛋白的提取量都較高，無(wú)顯著差別。綜上，水—氯化鈉—乙醇三步提取法提取的麩質(zhì)蛋白量較少，其余幾種方法提取的量較高；幾種方法均不能很好地提取出大麥中的高分子質(zhì)量谷蛋白，相對(duì)而言異丙醇結(jié)合DTT提取法對(duì)高分子質(zhì)量谷蛋白的提取效果最佳。

3 結(jié) 論

采用9種不同的方法提取小麥和大麥中的麩質(zhì)蛋白，并對(duì)其提取效果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)論如下：除水—氯化鈉—乙醇提取法不能完整提取小麥麩質(zhì)蛋白，其余幾種方法均成功提取麩質(zhì)蛋白。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度結(jié)果顯示，60%乙醇提取法和70%乙醇提取法提得的小麥中麩質(zhì)蛋白濃度最高，是提取小麥麩質(zhì)蛋白的最優(yōu)的兩種方法；對(duì)于大麥中麩質(zhì)蛋白的提取，70%乙醇提取法提得的蛋白濃度最高，異丙醇結(jié)合DTT法次之。而混合物提取法提取小麥和大麥中麩質(zhì)蛋白得到SDSPAGE條帶數(shù)最多，顯示混合物提取法可以提取麥類中高分子量麥谷蛋白。

參 考 文 獻(xiàn)

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Wang Jiajia1， Hu Huimin2， Pan Xuefeng1， Chen Xia3， Zhuang Xinbo1， Zhang Tao1， Chen Yinji1

（ 1. School of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing， Jiangsu 210023； 2. Anhui Yunyan Food Technology Co.， Ltd.， Xuancheng， Anhui 341881；

3. Agricultural and Rural Bureau of Gaochun District， Nanjing， Jiangsu 211300 ）

Abstract： Gluten of wheat and barley were extracted by nine extraction methods， SDS-PAGE was applied to separate and compare the extraction results. The results revealed that the extraction method of H2O-NaCl-ethanol could not completely extract gluten proteins， While other methods were successful. Mixture extraction， 60% ethanol extraction， Isopropanol/DTT extraction and 70% ethanol extraction obtained higher gluten content in barley. The mixture extraction method extracts the largest number of SDS-PAGE bands in grains and can extract high-molecular-weight glutenin.

Key words： wheat， barley， glulen protein， extraction method， SDS-PAGE