醬香型大曲中揮發(fā)性成分與微生物代謝關(guān)系

張小龍，邱樹毅，王曉丹，何宗杰，李玉德，曾 超，班世棟

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州遵義 564501；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025；3.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；4.米易華森糖業(yè)有限責任公司，四川攀枝花 617200；5.西安瑞聯(lián)新材料股份有限公司，陜西西安 710077）

醬香型大曲為白酒提供風味和風味前體物質(zhì)，白酒中許多香味成分在大曲中都能檢測到，比如三甲基吡嗪等雜環(huán)化合物[1]。近年來較多的使用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatograph and mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)分析大曲中的香味成分[2-3]，這不僅可以對大曲的揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測，對大曲的風味物質(zhì)做初步評定，而且也作為研究功能微生物發(fā)酵代謝風味物質(zhì)成分研究的檢測方法。目前，從醬香型大曲中共確定了259揮發(fā)性成分，其中酯類和醇類最多，其次包括吡嗪、醛、酮、酸、酚、呋喃、其他雜環(huán)、內(nèi)酯、醚、含硫類、芳香烴、脂肪烴等[4]。這些成分主要是細菌、霉菌和酵母在大曲發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生，細菌主要產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)醬香成分[5-6]，霉菌主要分泌淀粉酶起糖化作用[6-7]，而酵母主要產(chǎn)酒產(chǎn)香[4，8]。因此，大曲在發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的形成主要由細菌和酵母代謝產(chǎn)生。

醬香型大曲醬香來源最初認為是高溫制曲的美拉德反應(yīng)，徐巖等[9]對中國白酒中四甲基吡嗪的來源及產(chǎn)生機制進行研究，首次證實了中國白酒中四甲基吡嗪主要來源于微生物代謝合成，確定了中國白酒中四甲基吡嗪的產(chǎn)生機制。吳建峰[10]在對白酒中四甲基吡嗪代謝機理的研究也證實了徐巖有關(guān)枯草芽孢桿菌兩步法生產(chǎn)四甲基吡嗪的說法。在大曲中也分離到具有產(chǎn)醬香的能力的地衣芽孢桿菌，且發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)醬香的風味主要是吡嗪類和酮類物質(zhì)[11]。此外，從醬香型大曲中分離到多種酵母，其分離的酵母具有產(chǎn)果香、花香、產(chǎn)酒的能力[12]。通過比較機械化制曲和傳統(tǒng)大曲中酵母種類、生物量、產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力，發(fā)現(xiàn)機械化大曲中酵母生物量較高，雖然酵母種類只有傳統(tǒng)大曲的一半，但產(chǎn)酒能力和產(chǎn)香效果沒有明顯區(qū)別[13]，說明產(chǎn)香酵母對大曲風味的形成有重要作用。

本研究利用GC-MS分析遵義5個醬香型白酒廠釀酒用大曲揮發(fā)性成分，以及從大曲種分離產(chǎn)香酵母和細菌固態(tài)發(fā)酵后的揮發(fā)性成分，分析酵母和細菌與大曲揮發(fā)性成分的關(guān)系，為醬香型大曲的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：醬香型大曲樣品為儲存六個月粉碎釀酒用大曲粉（黃曲∶白曲∶黑曲為8∶1∶1），從遵義市5個醬香型白酒酒廠（非醬香酒核心生產(chǎn)區(qū)）取樣，分別標記為MF01、MF02、MF03、MF04、MF05。

菌株：從5個大曲樣品（MF01、MF02、MF03、MF04、MF05）中分離得到5株產(chǎn)香酵母和11株產(chǎn)醬香細菌，具體情況見表1。

表1 醬香大曲中分離篩選的產(chǎn)香酵母和產(chǎn)醬香細菌Table 1 Aroma-producing yeasts and sauce-flavor producing bacteria screened from sauce-flavor Daqu

續(xù)表

糖化酶：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；瓊脂（生化試劑）：重慶川江化學試劑廠；pH標準緩沖試劑：沈陽賽尼歐化工有限公司。

麥芽汁液體培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂：上海博微生物科技有限公司；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：高粱與小麥質(zhì)量比為1∶1，小麥全部粉碎，高粱整粒∶碎粒質(zhì)量比為3∶1；加水50%，混勻后90 ℃潤糧4 h；121 ℃蒸煮20 min；待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃加入糖化酶（200 U/g），調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至4.0～4.5，在60 ℃水浴鍋糖化4 h；裝瓶，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS：美國安捷倫科技有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；ZHWY-1118恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；FA2004N分析天平：上海菁海儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計：上海大普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及固態(tài)發(fā)酵

5株酵母和11株細菌分別在麥芽汁固態(tài)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30 ℃活化兩次。分別將活化的酵母和細菌接種到100 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h（此時酵母數(shù)量為3×107CFU/mL，細菌5×107CFU/mL），每株菌按4%的接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃發(fā)酵5 d，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行揮發(fā)性成分分析。

1.3.2 揮發(fā)性成分GC-MS分析

分別取5種大曲樣品、5株酵母發(fā)酵樣品和11株細菌發(fā)酵樣品20 g，置于50 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在60 ℃頂空萃取40 min取出，并立即進樣，進樣口溫度250 ℃，熱解吸3 min。

色譜條件：色譜柱為ZB-5MSI 5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫35 ℃，保持1 min；4 ℃/min升溫至135 ℃，保持2 min；8 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為氦氣（He）（99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量0.8 mL/min；分流比為10∶1。電子電離（electron ionization，EI）源，溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量范圍20～450 amu。

定性定量方法對總離子流圖中每條峰經(jīng)質(zhì)譜圖庫美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley275定性分析，確定揮發(fā)性化學成分，用峰面積歸一化法測定各化學成分的質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 大曲的揮發(fā)性成分分析

5個大曲樣品的揮發(fā)性成分分析結(jié)果見表2。

表2 大曲樣品的揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 2 Analysis results of volatile components of Daqu samples

續(xù)表

由表2可知，共檢測到51種揮發(fā)性成分，其中有乙醇、正丁醇、苯甲醇等7種醇，乙醛、2-甲基丙醛、戊醛等11種醛，乙酸、辛酸、棕櫚酸等5種酸，十四酸乙酯、棕櫚酸甲酯、油酸甲酯等10種高沸點酯，十二烷、十三烷、植烷等9種烷烴。此外，檢測到三甲基吡嗪和四甲基吡嗪、2-甲基呋喃、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基4甲基苯酚、丙酮和六氫法尼基丙酮。5個大曲的揮發(fā)性成分主要集中在棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、油酸甲酯等高沸點酯，相對含量達到37.91%～78.81%，與其他研究結(jié)果相同[15]。亞油酸乙酯是高沸點酯中相對含量最高，在醬香型白酒中也是最高的高沸點酯，可達到18.30 mg/L[15]。油酸乙酯、亞油酸乙酯和棕櫚酸乙酯能對白酒香味具有一定貢獻，但質(zhì)量濃度超過2 mg/L時，在低于25%vol白酒中容易引起白酒渾濁[16]。油酸甲酯、亞油酸甲酯和棕櫚酸甲酯也對醬香型白酒的空杯留香有一定貢獻，其在中溫曲中也檢測到[4]。

5個大曲樣品中，除四甲基吡嗪（相對含量14.77%）和6（E），8（E）-十七碳二烯（相對含量7.28%）在MF02中顯著高于其他樣品外，其他成分相對含量幾乎在1%以下。雖然大曲中微量成分較多，但是對白酒風味和風味前體物質(zhì)形成至關(guān)重要。四甲基吡嗪和三甲基吡嗪認為是醬香型白酒主要的醬香味成分[17-18]，而三甲基吡嗪只有在MF02中檢出，四甲基吡嗪在MF05中未檢出。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣，2-苯基乙醛具有類似風信子的香氣，水果甜香，壬醛稀釋時則呈現(xiàn)出玫瑰和柑橘樣的香氣，苯甲醇具有茉莉花油、風信子的芳香味[19]。此外，在MF03大曲中檢測到了2.7%的辛酸，具有汗臭味。此外，在MF03大曲中僅檢測到1-戊醇、十二烷、十三烷，MF04大曲中僅檢測到E2辛烯醛、辛酸，MF05大曲中僅檢測到植烷、2,3,5三甲基吡嗪。

2.2 細菌固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性成分分析

11株產(chǎn)香芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后，共檢測到74種揮發(fā)性成分，結(jié)果見表3。由表3可知，四甲基吡嗪在每株菌相對含量較高，最高可達到所有成分的47.41%，其次是乙偶姻和2,3-丁二醇每株菌的相對含量也較高，相對含量最高可達到所有成分的67.26%和27.17%。此外，分析發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能更好的代謝產(chǎn)生大量具有醬味的吡嗪類物質(zhì)（二甲基吡嗪和三甲基吡嗪）和酸味的物質(zhì)。細菌還可以代謝如3-甲基-2-丁烯酸、2-甲基-2-戊烯酸、D-檸檬烯這類的具有果香味的物質(zhì)，有苯乙醇、苯甲醇、苯乙醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚這類花香味的物質(zhì)，有2,4,5-三甲基惡唑這種焦糖香氣的物質(zhì)，也有2,3-丁二酮、乙偶姻這類奶香味物質(zhì)。

表3 細菌固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性成分分析Table 3 Volatile components analysis of solid-state fermentation product by bacteria

續(xù)表

四甲基吡嗪是醬香型白酒產(chǎn)生醬香的的重要風味物質(zhì)，在低溫、中溫和高溫大曲中都可以檢測到[4]。其合成前體是乙偶姻，具有奶油香味，與氨基酸可通過美拉德反應(yīng)生成四甲基吡嗪，或者通過微生物代謝酶促反應(yīng)生成四甲基吡嗪[20-22]。2,3-丁二醇是白酒中的醇甜物質(zhì)，在高溫大曲和中溫大曲中檢測到[4]。長期認為酵母是重要的產(chǎn)香微生物，而此實驗結(jié)果表明，細菌不僅產(chǎn)醬香物質(zhì)，也具有產(chǎn)果香、焦糖香等其他香味物質(zhì)的功能。且細菌固態(tài)發(fā)酵為大曲提供10種揮發(fā)性成分，但是其他大多數(shù)成分能夠在白酒中檢測到，可能是細菌在小麥和高粱為原料發(fā)酵的差異。細菌固態(tài)發(fā)酵可產(chǎn)生比大曲更多種類的揮發(fā)性成分，無高沸點酯，但為大曲風味的形成提供了前體物質(zhì)，如乙偶姻、苯乙醇等。

2.3 酵母固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性成分分析

5株產(chǎn)香酵母固態(tài)發(fā)酵后的揮發(fā)性物質(zhì)測定結(jié)果見表4。由表4可知，檢測到79種揮發(fā)性物質(zhì)，這些揮發(fā)性香味物質(zhì)主要是酯類和醇類，還有少量醛、酮、酚和烷類等物質(zhì)，其中苯乙醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯等26種化合物可產(chǎn)生濃郁的果香味。4株酵母乙醇相對含量較高，最高可達到50.91%，MF05樣品中的FBKL2.0094的通過固態(tài)發(fā)酵能產(chǎn)生相對含量57.3%的乙醇，并能產(chǎn)生9.35%乙酸異丁酯，這使得發(fā)酵產(chǎn)物具有濃郁的水果香氣。FBKL2.0087中帶來水果香味成分的是27.94%丁酸乙酯。在MF04中FBKL2.0082固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性香味成分中，有果香味的乙酸乙酯，有香蕉和梨的香味的乙酸異戊酯等酯類化合物，此外還具有玫瑰香氣的苯乙醇；FBKL2.0083具有很高的產(chǎn)酒能力，發(fā)酵能產(chǎn)生一定量的2-甲基丁酯，也能產(chǎn)生4%～5%的苯乙醇、乙酸苯乙酯，這兩種物質(zhì)具有玫瑰花的香氣，是醬香型白酒中重要的香氣物質(zhì)。MF01樣品中的FBKL2.0302固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性香味成分中，以有具有玫瑰香氣的苯乙醇含量較高，占了揮發(fā)性成分含量的49.13%，而其他產(chǎn)物也在不同程度上呈現(xiàn)出花香，但其產(chǎn)乙醇能力不高。

表4 酵母固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性成分分析Table 4 Volatile components analysis of solid-state fermentation product by yeast

續(xù)表

酵母可為大曲提供25種揮發(fā)性成分，其中有高沸點酯：棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和油酸乙酯等（表4）。但大多數(shù)揮發(fā)性成分能夠在白酒中檢測到，說明酵母在高粱發(fā)酵環(huán)境能產(chǎn)生更多的風味成分。此外，愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚等也在酵母固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性成分中檢測到，這幾種成分早期認為是醬香型白酒的主體香[23]，雖然試驗證實愈創(chuàng)木酚類化合物不是醬香型白酒主體香，但是帶木香和香莢蘭的隱香，是醬香型白酒中風味成分的重要物質(zhì)，此類化合物也在濃香型白酒、清香型白酒和葡萄酒中檢測到[24-25]。

2.4 細菌和酵母對大曲風味的貢獻

由圖1可知，通過揮發(fā)性成分分析，醬香型大曲、酵母發(fā)酵物和細菌發(fā)酵物分別有51、75和74種揮發(fā)性成分，其中，酵母固態(tài)發(fā)酵物只有13種成分在大曲中檢測到，細菌固態(tài)發(fā)酵物只有6種成分在大曲中檢測到。此外，酵母和細菌固態(tài)發(fā)酵物有6種相同成分。

圖1 揮發(fā)性成分韋恩圖分析Fig.1 Venn diagram analysis of volatile components

3 結(jié)論

醬香型大曲中有醇、醛、酸、酯、吡嗪、酮、酚類等51種揮發(fā)性成分，其中棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸甲酯等6種高沸點酯是大曲中主要揮發(fā)性成分，這些成分由酵母代謝提供，而芽孢桿菌代謝產(chǎn)生大量具有醬味的吡嗪類物質(zhì)和酸味的物質(zhì)。此外，芽孢桿菌在發(fā)酵過程中也提供果香味成分，酵母為白酒除提供果香味成分外，也提供重要風味成分愈創(chuàng)木酚類化合物。