釀造米酒發(fā)酵條件的優(yōu)化

袁華偉，張 健，張雪婷，屠婷瑤，劉光錢，張立強，沈才洪，王松濤

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；4.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000）

釀造米酒是我國一種傳統(tǒng)的酒精飲品，酒精度一般在5%vol～14%vol，顏色呈淡黃色或乳白色，除具有獨特的香氣、清爽的口感外，還含有豐富的營養(yǎng)成分[1]。米酒中含有適量的麥芽糖等易于吸收的小分子糖類、多種氨基酸（包括8種人體不可缺少的必需氨基酸）、有機酸、礦物質(zhì)、維生素等[2-5]。傳統(tǒng)中醫(yī)學認為米酒具有消食健脾、溫寒補虛、提神解乏、解渴消暑等功效。動物實驗發(fā)現(xiàn)，米酒能明顯增加腹腔巨噬細胞的吞噬能力，從而提高免疫能力，還可通過抗氧化作用抑制衰老癥狀[6-7]。隨著人們生活水平的提高，米酒越來越受到消費者的青睞。

我國米酒的釀造具有悠久的歷史，產(chǎn)地分布廣泛。近年來國內(nèi)對米酒的研究主要集中在對某些特定原料及地域性米酒品質(zhì)的分析[8-12]、米曲微生物群落結構的研究及相關微生物的分離鑒定[13-16]、新型米酒產(chǎn)品的開發(fā)等方面[17]。對米酒生產(chǎn)工藝的研究僅限于利用酒曲發(fā)酵及對香氣成分的影響[18-19]，而以米曲霉、釀酒酵母等微生物釀造米酒的發(fā)酵工藝條件研究鮮見報道。

米酒種類較多，由于受地域性、工藝技術、生產(chǎn)原料等因素的影響，傳統(tǒng)米酒是用蒸熟的米飯拌上米曲經(jīng)發(fā)酵、過濾而成，受米曲中微生物菌群的影響，造成米酒品質(zhì)參差不齊，同一企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量也不穩(wěn)定。以米曲霉為糖化劑、酵母為發(fā)酵劑的米酒生產(chǎn)新工藝可對發(fā)酵工藝過程進行控制，以穩(wěn)定其質(zhì)量，從而開發(fā)出口感協(xié)調(diào)、香氣較好、質(zhì)量穩(wěn)定的米酒。本研究以米曲霉（Aspergillus oryzae）及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發(fā)酵菌株，采用兩步發(fā)酵法研制釀造米酒，通過測定釀造米酒的酒精度、總糖、總酸、風味物質(zhì)和感官評價等指標，確定最佳的釀造米酒發(fā)酵工藝條件，為釀造米酒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

大米、麩皮：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LB-05、米曲霉（Aspergillus oryzae）YM-16：本實驗室篩選，均來源于米曲；傳統(tǒng)米酒：本實驗室以酒曲為糖化發(fā)酵劑釀造[18]。

1.1.2 化學試劑

酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：成都科龍化學試劑廠；白酒色譜混合標樣：鄭州譜析科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，121 ℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮∶水=1.0∶0.8（g∶mL），121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州合飛凈化設備有限公司；LDZX-75KBS高溫蒸汽滅菌鍋：上海申安有限公司；HHW21-600S恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市正基儀器有限公司；MJ-250-H恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學儀器有限公司；HEIVAPPRE-CISION旋轉蒸發(fā)儀：上海賢德實驗儀器有限公司；7890A氣相色譜分析儀：美國安捷倫科技有限公司；LZP-930色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm）：中科院蘭州化學物理研究所；MX-301離心機：日本Tomy公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造米酒工藝流程及操作要點

操作要點：

大米浸泡、蒸煮：大米淘洗2～3遍后，加3倍水于常溫條件下浸泡1 h，濾掉水分，于蒸鍋上蒸煮約1 h，至全部熟透用手捏富有彈性且不粘手時為止。

霉菌孢子懸浮液制備：霉菌菌種接種于麩皮培養(yǎng)基上，每24 h搖動一次，28 ℃培養(yǎng)72 h后加入200 mL滅菌水搖勻，用滅菌后的雙層紗布過濾，濾液即為孢子懸浮液，孢子濃度為105～106個/mL。

米曲制備：大米經(jīng)除雜清洗、浸泡、蒸煮，冷卻至30～40 ℃左右，分裝在搪瓷盤中，按原料米質(zhì)量的1%加入孢子懸浮液。控制溫度為38 ℃、相對濕度為95%。培養(yǎng)48 h后，攤開混合均勻再堆積，在32 ℃和95%相對濕度條件下培養(yǎng)24 h。最后控制溫度至40 ℃，相對濕度50%，保持12 h，干燥后得到米曲[20]。

酒母制備：取酵母菌于YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，在25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，每日搖動混勻1～2次，2～3 d后至酵母數(shù)（1.0～1.5）×108個/mL，即得釀造米酒所需酒母。

第一次發(fā)酵：稱取米曲82.5 g放入1 000 mL三角瓶中，加入100 mL滅菌水，再加入酒母1 mL，混合均勻后，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)3d，每天搖動一次，進行米酒的一次發(fā)酵。

第二次發(fā)酵：取250 g大米，經(jīng)除雜清洗、浸泡、蒸煮，冷卻后加入一次發(fā)酵后的三角瓶中，并加入450 mL無菌水。在恒溫箱中進行二次發(fā)酵，每天搖動一次，過濾后的清液即得釀造米酒[21]。

1.3.2 釀造米酒發(fā)酵條件的優(yōu)化

分別使酵母接種量為原料大米量的0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%，在21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃條件下進行發(fā)酵1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、13 d、15 d、17 d?？疾旖臃N量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對釀造米酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 不同方法釀造米酒的品質(zhì)特性

分析兩步發(fā)酵方法和傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的米酒中酒精度、總糖、總酸、風味物質(zhì)等理化指標，并進行感官品評，比較不同方法釀造米酒的品質(zhì)。

1.3.4 分析方法

酒精度：采用氣相色譜法測定[21]；總酸含量：采用酸堿滴定法測定[22]；總糖含量：采用DNS法測定[23]。

米酒中的風味物質(zhì)含量采用氣相色譜法檢測。樣品處理方法：米酒在2 300×g、4 ℃條件下離心5 min，上清液經(jīng)0.22μm薄膜過濾器過濾。氣相色譜條件如下：載氣為高純氮氣（N2），氫氣（H2）流量為30 mL/min，空氣流量為400 mL/min；進樣溫度及檢測溫度均為220 ℃，進樣量0.4 μL，分流比10∶1；柱溫55 ℃，保持3 min，以3.5 ℃/min的速率升溫至150 ℃，保持1 min；以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持30 min。以保留時間定性、內(nèi)標法計算各風味物質(zhì)的含量。

1.3.5 米酒中風味物質(zhì)的氣味活性值計算

以傳統(tǒng)自然發(fā)酵的米酒為對照，根據(jù)測定的米酒風味物質(zhì)含量，通過風味成分的嗅覺閾值，按如下公式計算各種成分的氣味活度值（odor activity value，OAV），其計算公式如下：

式中：C1表示風味物質(zhì)的含量，mg/mL；C0表示風味物質(zhì)的閾值，μg/L。

依據(jù)米酒風味物質(zhì)的OAV值作米酒風味輪廓圖。

1.3.6 感官評定

參考GB/T 13662—2018《黃酒》中的感官評定方法，組建感官評定小組，對釀造米酒的外觀、香氣、滋味、整體協(xié)調(diào)度4個方面進行評價[24]，滿分100分，感官評定標準見表1。

表1 釀造米酒的感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of brewed rice wine

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用Excel 2010作圖；采用SPSS 16.0進行單因素方差分析，顯著性水平為0.05，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同酵母接種量對釀造米酒的影響

由表2可知，風味物質(zhì)中乙醛、正丙醇的含量差異較大（P＜0.05）。乙酸β-苯乙酯的含量差異不顯著（P＞0.05），乙酸在接種量0.8%～1.0%及1.2%～1.6%時有顯著差異（P＜0.05）。接種量為1.0%時，釀造米酒中乙酸乙酯、異戊醇、β-苯乙醇、乙酸異戊酯含量較高。

由表3可知，接種量1.4%時米酒的酒精度最高（14.59%vol），但其總糖含量最低（0.64 g/L）；接種量1.2%時的總酸最高（1.94 g/L）。釀造米酒的米曲霉含豐富的淀粉酶、蛋白酶等酶類，酶解淀粉為糖類，還產(chǎn)檸檬酸、乳酸等有機酸[25]，所以米酒中含有糖分和有機酸。接種量大，酵母生長旺盛，產(chǎn)酒能力就強；總糖和總酸含量的變化，可能是由于酵母和米曲霉中的酶相互作用的結果。適量的糖和酸能提高米酒品質(zhì)，從理化指標結果來看，接種量1.0%為宜。感官品評結果顯示，接種量0.8%、1.2%時的米酒感官品評得分較低，原因可能是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了不利于口感的物質(zhì)。接種量1.0%時發(fā)酵的米酒感官品評得分最高（81.62分），在口感上相對較好，總酸和總糖含量比較適宜，米酒酸甜適口。從感官得分結果來看，酵母接種量1.0%為宜。

表2 不同酵母接種量對發(fā)酵米酒的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of different yeast inoculum on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine

表3 不同酵母接種量對釀造米酒理化指標和感官評分的影響Table 3 Effect of different yeast inoculum on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine

2.2 發(fā)酵溫度對釀造米酒的影響

由表4可知，不同發(fā)酵溫度乙醛、乙酸異戊酯的含量有顯著差異（P＜0.05）；β-苯乙醇差異不顯著（P＞0.05）。25 ℃發(fā)酵的米酒中乙酸異戊酯、乙酸β-苯乙酯的含量最高，分別為4.06 mg/L、26.94 mg/L。異戊醇、β-苯乙醇隨發(fā)酵溫度的升高略有減少，原因可能是較高的溫度導致相關的酶類活性降低。

由表5可知，不同發(fā)酵溫度條件下釀造米酒在酒精度和酸度上差別不顯著（P＞0.05）；21～23 ℃及25～29 ℃發(fā)酵時有顯著差異（P＜0.05）。21 ℃時釀造米酒的總糖量最高，為1.49 g/L?？赡苁请S著發(fā)酵溫度的升高，米曲霉的酶活性受到影響，造成分解淀粉的能力降低，發(fā)酵溫度較高時釀造米酒的總糖量較少。由于米酒發(fā)酵過程中的溫度適宜酵母菌的作用，不同發(fā)酵溫度對酒精度和酸度的影響不大。25 ℃發(fā)酵的釀造米酒感官品評得分最高（81.18分）。糖度和酸度對米酒口感的影響較大，25 ℃發(fā)酵時釀造米酒風味物質(zhì)的含量較協(xié)調(diào)，口感也相對較好，曲霉菌產(chǎn)酶活性最佳[25]。因此，確定釀造米酒的最適發(fā)酵溫度為25 ℃。

表4 不同發(fā)酵溫度對釀造米酒揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的影響Table 4 Effect of different fermentation temperature on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine

表5 不同發(fā)酵溫度對釀造米酒理化指標和感官評分的影響Table 5 Effect of different fermentation temperature on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine

2.3 發(fā)酵時間對米酒品質(zhì)的影響

由表6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，釀造米酒的風味物質(zhì)含量也隨著增加，在發(fā)酵前5 d，釀造米酒的風味物質(zhì)含量快速上升，在發(fā)酵13 d時趨于穩(wěn)定。釀造米酒特征香氣成分乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量在發(fā)酵前5 d分別從6.12 mg/L、4.62 mg/L上升至18.63 mg/L、87.76 mg/L，到13 d時緩慢上升至23.47 mg/L、120.22 mg/L。到發(fā)酵13 d后，釀造米酒中風味物質(zhì)含量的差異不顯著（P＞0.05），延長發(fā)酵時間增加米酒中風味物質(zhì)含量的意義不大，13 d的發(fā)酵時間較為適宜。

表6 不同發(fā)酵時間對釀造米酒揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的影響Table 6 Effect of different fermentation time on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine

續(xù)表

表7 不同發(fā)酵時間對釀造米酒理化指標和感官評分的影響Table 7 Effect of different fermentation time on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine

由表7可知，在發(fā)酵前5 d，釀造米酒的酒精度快速上升，從2.39%vol上升至12.71%vol，隨后酒精度變化不大，發(fā)酵13 d米酒酒精含量為13.21%vol。發(fā)酵前3 d釀造米酒釀造體系中的淀粉水解酶起作用，將淀粉水解為糖類，總糖含量有所上升，3～5 d時酵母利用糖類產(chǎn)酒，總糖含量快速下降，從19.74 g/L下降至2.62 g/L，與酒精含量的變化趨勢相反；前期總酸含量緩慢上升。7 d后的總酸、總糖含量趨于穩(wěn)定，是由于釀造體系中的可發(fā)酵性糖被利用完及少有酸產(chǎn)生。從理化指標結果來看，發(fā)酵時間13 d為宜。且此條件下時釀造米酒口感較好，感官品評得分最高，為87.14分。因此，確定米酒的最適發(fā)酵時間為13 d。

2.4 釀造米酒的風味特征

采用不同方法釀造米酒的理化指標和感官得分見表8，相關揮發(fā)性風味物質(zhì)的嗅覺閾值、感官描述風味物質(zhì)含量和OAV見表9，選擇OAV較高的風味物質(zhì)為主體特征作米酒的風味輪廓圖見圖1。

表8 兩種米酒的理化指標和感官評分Table 8 Physiochemical indexes and sensory score of two kinds of rice wine

由表8可知，釀造的米酒和傳統(tǒng)米酒的酒精度、總酸、總糖和感官評分有顯著差異（P＜0.05）。釀造米酒酒精度和感官評分較高，而總酸、總糖較低，可能是由于傳統(tǒng)方法釀造過程中對糖的利用較好，受雜菌污染產(chǎn)生了較多的酸。

表9 兩種米酒中風味物質(zhì)的嗅覺閾值及香氣活性值Table 9 Olfactory threshold and OAV of flavor compounds in two kinds of rice wine

由表9可知，米酒特征香氣成分乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量無顯著差異（P＞0.05），表明釀造米酒與傳統(tǒng)米酒的風味無明顯差異；其他成分除異丁醇外具有顯著差異（P＜0.05）。不同揮發(fā)性組分的氣味閾值顯著不同，含量較低的物質(zhì)可能由于其閾值極其低，使得其OAV非常高。通常認為OAV＞1的物質(zhì)對米酒的風味有貢獻，OAV＞10的則認為是重要香氣物質(zhì)[29]。

圖1 米酒風味輪廓特征Fig.1 Aroma characteristics of rice wine

選擇OAV較高的風味物質(zhì)為主體特征，包括具有香蕉香味的乙酸異戊酯、具有花香味的乙酸β-苯乙酯、具有蘋果香味的己酸乙酯、具有青草味的乙縮醛和醇香味的正丁醇。由圖1可知，釀造米酒與傳統(tǒng)米酒的主體風味特征為水果香和花香，并有醇香和青草香等；顏色呈米黃色，酒體豐滿醇和，香氣自然純正。

3 結論

釀造米酒的適宜酵母菌接種量為1.0%，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時間為13 d。在此最佳條件下，釀造米酒酒精度13.21%vol，總酸1.37 g/L，總糖0.95 g/L，感官評分87.14分。米酒關鍵香氣物質(zhì)乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量分別為23.47 mg/L、120.22 mg/L，釀造米酒的主體風味特征為水果香、花香和醇香等，口感較好，與傳統(tǒng)發(fā)酵米酒的風味特征無明顯差異，可為釀造米酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。