沉默Pard3 基因?qū)m頸癌細(xì)胞系SiHa 遷移、侵襲的影響及其機(jī)制

劉迎嘉，阿仙姑·哈斯木

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊830011；2 新疆醫(yī)科大學(xué)

研究［1］顯示，宮頸癌晚期復(fù)發(fā)患者預(yù)后差，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。分離缺陷基因3（Pard3）的產(chǎn)物是一種分布在正常細(xì)胞的極性蛋白，它的改變和缺失都會(huì)造成腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移［2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，JAKs/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期、抗凋亡等作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前關(guān)于Pard3 和JAK2/STAT3 在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不清楚。2017 年 6 月 1 日—2020 年 6 月 30日，本研究觀察了沉默Pard3 基因?qū)m頸癌細(xì)胞系SiHa遷移、侵襲的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分組及Pard3 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染 將人宮頸癌細(xì)胞系SiHa 細(xì)胞培養(yǎng)于10% 胎牛血清的DMEM 中，37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)用PBS 清洗、0.25%的胰蛋白酶消化后，加入完全培養(yǎng)基，按 1∶3 的比例傳代，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。針對(duì)Pard3 轉(zhuǎn)錄本（GAAGGTCTATGTCTACTGA 和GAAACAGCGTT?GGATGATA）設(shè)計(jì)小干擾RNA（siRNA）1 和siRNA2序 列 ，分 別 為 GGATAACAGTCGTGTTGAA、GAAGGTCTATGTCTACTGA，并構(gòu)建Pard3基因沉默腺病毒表達(dá)載體。將SiHa 細(xì)胞分為siRNA1 組、siR?NA2 組、siRNC 組，siRNA1 組轉(zhuǎn)染 siRNA1，siRNA2組轉(zhuǎn)染siRNA2，siRNC 組轉(zhuǎn)染空白載體，轉(zhuǎn)染后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h。

1.2 三組細(xì)胞遷移和侵襲能力觀察 采用Tran?swell 遷移和侵襲試驗(yàn)。①Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)：取處理好的SiHa 細(xì)胞PBS 清洗，0.25%胰酶消化收集，1 000 r/min 離心 5 min，去上清，PBS 潤(rùn)洗兩次，清洗掉殘余血清，加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2.5×105/mL，備用。DMEM 培養(yǎng)基中加入Tran?swell 小室，分別接入 200 μL 各組細(xì)胞懸液，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出Transwell 小室，PBS 清洗，70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h，用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移細(xì)胞擦干凈，200 倍顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移相對(duì)數(shù)量。各組細(xì)胞遷移相對(duì)數(shù)量=各組遷移細(xì)胞數(shù)/siRNC 組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。②侵襲實(shí)驗(yàn)：取處理好的SiHa 細(xì)胞PBS 清洗，0.25%胰酶消化收集，1000 r/min 離心5 min，去上清，PBS 潤(rùn)洗兩次，清洗掉殘余血清，加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2.5×105/mL，備用。DMEM 培養(yǎng)基中加入Transwell 小室后，于上室底部中央垂直加入100 μL終濃度為1 mg/mL的Matrigel，待Matrigel 干成膠狀后在Transwell 上室分別接入200 μL 各組細(xì)胞懸液，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出Transwell小室，PBS清洗，70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h，用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未侵襲細(xì)胞擦干凈，200 倍顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞侵襲相對(duì)數(shù)量。各組細(xì)胞侵襲相對(duì)數(shù)量=各組侵襲細(xì)胞數(shù)/siRNC組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 三組細(xì)胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRTPCR）法。取各組細(xì)胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA，Prime-Script 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以 cDNA 為模板，以GAPDH 為內(nèi)參基因，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物序列如下：Pard3 上游引物為 5′-CAGGTGCATCGCTT?GGAAC-3′，下游引物為 5′-GCTGAGACATTGTTG?GTGCC-3′；JAK2 上 游 引 物 為 5′-GTCATG?GCCCAATTTCGATGG-3′，下游引物為5′-TCGCTC?GACAGCAAAAGTCA-3′；STAT3 上 游 引 物 為 5′-AGAAAACATGGCTGGCAAGG-3′，下游引物為 5′-GCCTCCTTCTTTGCTGCTTT-3′；E-cadherin 上游引物為 5′-CGTAGCAGTGACGAATGTGG-3′，下游引物為 5′-CTGGGCAGTGTAGGATGTGA-3′；Vimentin上游引物為5′-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3′，下游引物為5′-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-3′。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè) 循 環(huán) 。 以 2-ΔΔCt表 示 細(xì) 胞 中 目 的mRNA的相對(duì)表達(dá)量

1.4 三組細(xì)胞中Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白檢測(cè) 采用 West?ern blotting 法。取各組細(xì)胞，用Cell Mitochondria Isolation Kit 試劑盒分離線(xiàn)粒體和細(xì)胞漿蛋白，使用DG-3022A 酶標(biāo)儀測(cè)定OD568值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD 值計(jì)算直線(xiàn)回歸方程得出樣品蛋白濃度。將提取的蛋白上清沸水浴變性后和MARKER加入上樣孔進(jìn)行電泳分離，取出凝膠根據(jù)MARKER切下目的條帶轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉液浸泡PVDF 膜進(jìn)行封閉，4 ℃條件下過(guò)夜，加入兔單克隆抗體，用PBS-Tween 20洗滌印跡3次，洗滌后HRP 二抗顯影、沖洗膠片，用BandScan 分析膠片灰度值，以灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x ± s表示，比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 ①siRNA1組、siRNA2 組、siRNC 組細(xì)胞遷移相對(duì)數(shù)量分別為122.3±4.3、129.2±7.1、100.0±7.1，其中siRNA1組、siRNA2 組遷移相對(duì)數(shù)量與 siRNC 組相比，P均＜0.05。②siRNA1 組、siRNA2 組、siRNC 組細(xì)胞侵襲相對(duì)數(shù)量分別為120.5 ± 5.8、131.3 ± 7.9、100.0 ±9.0，其中 siRNA1 組、siRNA2 組侵襲相對(duì)數(shù)量與siRNC組相比，P均＜0.05。

2.2 三組細(xì)胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 siRNA1 組細(xì)胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.7±0.2、1.2±0.3、1.1±0.1、0.7 ± 0.1、1.9 ± 0.3，siRNA2 組分別為 0.4 ± 0.1、1.0± 0.3、1.1± 0.2、0.5± 0.1、2.4± 0.3，siRNC組分別為 1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1，其中 siRNA1 組、siRNA2 組 Pard3、E-cad?herin、Vimentin mRNA 相對(duì)表達(dá)量與 siRNC 組相比，P均＜0.05。

2.3 三組細(xì)胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較siRNA1 組中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vi?mentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為70.8 ± 1.5、101.9 ± 1.4、103.4 ± 7.0、74.6 ± 1.2、152.6 ± 7.4、174.7 ± 11.7、169.0 ± 6.0，siRNA2 組分別為49.6±1.0、102.1±0.9、100.0±6.3、62.6±2.1、182.9 ± 4.4、220.4 ± 5.8、191.7 ± 9.7，siRNC組分別為 100.0 ± 3.6、100.0 ± 3.3、100.0 ± 2.7、100.0 ± 3.1、100.0 ± 1.4、100.0 ± 5.5、100.0 ±3.2，其中 siRNA1 組、siRNA2 組 Pard3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá) 量 與siRNC組相比，P均＜0.05。

3 討論

腫瘤進(jìn)展的第一步是腫瘤細(xì)胞脫離環(huán)境獲得運(yùn)動(dòng)性和侵襲性，與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的特征相對(duì)應(yīng)［4］。在EMT 進(jìn)程中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間連接和頂端極性，獲得間質(zhì)和遷移特性，發(fā)生細(xì)胞形態(tài)和遺傳標(biāo)記的改變，包括上皮標(biāo)記（如E-cadherin）的消失和獲得間充質(zhì)標(biāo)記（如a-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白）［5-6］。研究［7］顯示，細(xì)胞間相互連接作用減弱、失去細(xì)胞間黏連并改變細(xì)胞極性，往往是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的關(guān)鍵原因，而上皮細(xì)胞極性主要是依靠極性蛋白來(lái)調(diào)控的。

正常上皮細(xì)胞沿內(nèi)部尖端基底軸呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的不對(duì)稱(chēng)分布，呈現(xiàn)極性狀態(tài)，這種極性狀態(tài)是由極性蛋白介導(dǎo)的。目前已知的極性蛋白有PAR 家族，包括 aPKC、Pard3 和Pard6 構(gòu)成的極性復(fù)合物。研究［8］發(fā)現(xiàn)，在食管癌、乳腺癌、肺癌等細(xì)胞中，極性和上皮組織的喪失與惡性腫瘤和腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)siRNAPard3 食管鱗狀細(xì)胞癌109 細(xì)胞系的研究［8］發(fā)現(xiàn)，Pard3 過(guò)表達(dá)降低了109 細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖率，抑制了DNA 復(fù)制，抑制了腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，而沉默Pard3 則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡；與對(duì)照組相比，Pard3 過(guò)表達(dá)顯著降低約50%的細(xì)胞侵襲能力，而沉默Pard3則顯著促進(jìn)109細(xì)胞的侵襲能力。乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 和SK-BR3 中過(guò)表達(dá)GAB1 增強(qiáng)了與Pard3 的相互作用，導(dǎo)致了Pard3與非典型PKC 極性蛋白復(fù)合物的解離，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移。有報(bào)道在人肺腺癌組織中Pard6b 和PKC 的表達(dá)低于癌旁正常肺組織，實(shí)驗(yàn)小鼠腺癌組織中Pard3 和PKC 水平亦降低；此外發(fā)現(xiàn)Pard3 基因體中的甲基化位點(diǎn)與Pard3 的表達(dá)呈正相關(guān)，Pard3基因的甲基化增加了細(xì)胞對(duì)卡鉑的敏感性，對(duì)Pard3的抑制增加了肺癌細(xì)胞的化療耐藥性。

本研究利用沉默Pard3 基因載體轉(zhuǎn)染SiHa 細(xì)胞，與對(duì)照組siRNC相比，實(shí)驗(yàn)組siRNA1、siRNA2轉(zhuǎn)染48 h 后Pard3mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量呈明顯現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中siRNA2 組下降更為顯著，說(shuō)明基于Pard3 轉(zhuǎn)錄本的兩條小干擾RNA 序列設(shè)計(jì)成功，同時(shí)Pard3基因沉默腺病毒載體轉(zhuǎn)染SiHa 細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)亦成功。體外siRNA 成功沉默Pard3 基因后，通過(guò)對(duì)Transwell 小室的基底膜進(jìn)行侵襲、遷移后附著的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，說(shuō)明沉默Pard3 后Si?Ha 細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng)。ZHANG 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-483可增加Pard3的表達(dá)，抑制miR-483可降低TGF-271 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲能力，Pard3的下調(diào)導(dǎo)致了間變性甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲，提示Pard3 過(guò)表達(dá)可減弱腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力，而Pard3低表達(dá)或沉默則增強(qiáng)細(xì)胞侵襲、遷移。

JAKs/STAT3 是惡性腫瘤增殖、進(jìn)展和凋亡的經(jīng)典途徑。LI 等［10］通過(guò)建立 3p22.2 抑癌基因與STAT3形成蛋白復(fù)合物，阻斷STAT3與JAK2相互作用和 STAT3 磷酸化，IL-6 的刺激增強(qiáng)了 DLEC1 與STAT3 的結(jié)合，使STAT3 與JAK2 的相互作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致STAT3 磷酸化水平降低，最終導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。WANG 等［11］體外研究發(fā)現(xiàn)，抑制LINC00518 表達(dá)可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。LINC00518的下調(diào)抑制了JAK/STAT3 的激活，進(jìn)而降低了N-cad?herin 和 Vimentin 的表達(dá)。研究［12］發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中不同抑癌基因可以通過(guò)調(diào)控JAK/STAT3 通路的活性來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生。有學(xué)者［13］首次報(bào)道宮頸鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)抑癌蛋白M 受體（OSMR）、抑癌蛋白（OSM）及STAT3持續(xù)激活而調(diào)控細(xì)胞自主前饋信號(hào)通路。與抑癌蛋白M 受體過(guò)表達(dá)相關(guān)的惡變前效應(yīng)主要是由JAK-STAT3 激活介導(dǎo)的，此通路受外源性O(shè)SM 和自分泌OSM-OSMR 相互作用所調(diào)控。通過(guò)中和抗體特異性抑制OSM-OSMR 相互作用，顯著抑制STAT3 激活和前饋信號(hào)，導(dǎo)致侵襲、血管生成和遷移減少，提示STAT3被激活、STAT3信號(hào)通路被抑制可能是宮頸癌干預(yù)治療的有效靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染后的siRNC組相比，siRNA1組、siRNA2組的JAK2、STAT3 的mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異，而磷酸化的JAK2 和STAT3 蛋白表達(dá)增加，siRNA2 組升高顯著，說(shuō)明沉默Pard3 基因上調(diào)JAK2/STAT3 磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮生物調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移。

E-cadherin 是一種分布在細(xì)胞表面和細(xì)胞間連接處的細(xì)胞黏附分子，表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞連接的破壞，腫瘤組織中E-cadherin 表達(dá)缺失提示腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的可能性較高。Vimentin 主要分布在間葉組織中，因此，E-cadherin 和Vimentin 常被作為腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化即EMT 的遺傳標(biāo)記。LI等［14］在體外肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞系中通過(guò)靶向E-cad?herin、N-cadherin、Vimentin 和 Twist 相 關(guān) 蛋 白 1（Twist），探討了腫瘤抑制因子UPF1 表達(dá)水平對(duì)EMT 過(guò)程的影響，結(jié)果顯示，UPF1 過(guò)表達(dá)時(shí)，N-cad?herin、Vimentin 和 Twist 表達(dá)水平明顯上調(diào)，E-cad?herin 表達(dá)下調(diào)，蛋白陣列分析則報(bào)道了相反的結(jié)果。ZHOU 等［15］用免疫組化染色檢測(cè) 10 例良性和42 例口腔鱗癌腫瘤組織E-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)，E-cadherin 在正?？谇火つど掀ぶ嘘?yáng)性表達(dá)，而波形蛋白在正?？谇火つど掀ぶ形匆?jiàn)表達(dá)；42 人中有26 人（61.9%）和16 人（38.1%）表達(dá)E-cadherin 和Vimentin，E-cadherin、Vimentin 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有顯著相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA1組和siRNA2組中E-cadherin mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，siRNA2組降低更顯著；siRNA1組和siRNA2組VimentinmRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，其中siRNA2 組顯著升高，提示Pard3 沉默后，SiHa細(xì)胞的上皮特征減弱、間質(zhì)特征增強(qiáng)，導(dǎo)致明顯的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化加速EMT進(jìn)程。

綜上所述，沉默Pard3 通過(guò)上調(diào)JAK2/STAT3 信號(hào)通路磷酸化，促進(jìn)SiHa 細(xì)胞遷移和侵襲并發(fā)生明顯的EMT，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。