香豆素衍生物熒光探針研究進展

魏含笑，張樂華，王英驥

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150081）

香豆素?zé)晒馓结樉哂泄鈱W(xué)活性好、熒光量子產(chǎn)率高、Stokes 位移大、溶解性好、光穩(wěn)定性強等優(yōu)點，在化學(xué)、生物學(xué)、臨床生物化學(xué)和環(huán)境學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。目前市售的熒光探針種類繁多，但功能單一，僅用于分析檢測。天然產(chǎn)物香豆素不僅具有優(yōu)良的藥理活性，而且分子結(jié)構(gòu)中含有發(fā)光基團，因而設(shè)計開發(fā)具有治療及檢測雙重作用的新型香豆素?zé)晒鈧鞲衅鞒蔀檠芯繜狳c。

香豆素類化合物的基本母核為苯駢α吡喃酮，具有優(yōu)良的熒光性能，活性位點多樣且易于結(jié)構(gòu)改造，香豆素本身具有抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗骨質(zhì)疏松、保護心血管系統(tǒng)等藥理作用，其7、8 位為主要活性修飾部位，對其主要活性部位進行修飾，合成新的香豆素衍生物熒光探針，在香豆素母核上引入特定的官能團，可擴大其在生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。近年來，已報道的香豆素衍生物熒光探針研究成果與日俱增，設(shè)計合成的香豆素類熒光探針具有多種用途且應(yīng)用價值較高，尤其在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用較為突出，包括檢測重金屬離子、含硫化合物、活性氧、蛋白質(zhì)以及監(jiān)測細(xì)胞結(jié)構(gòu)等。筆者對近5 年來設(shè)計合成的香豆素?zé)晒馓结樤跈z測過氧化氫、一氧化氮、次氯酸根離子、含硫化合物、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、毒性物質(zhì)等方面的應(yīng)用研究進展進行了綜述。

1 檢測過氧化氫

Li 等［1］采用苯并噻唑-2-基-7-羥基香豆素與3-(苯并噻唑-2-基)-7-羥基香豆素結(jié)合生成一個環(huán)形配體，得到雙氧水的中性銥絡(luò)合型磷光探針，苯硼酸頻哪醇酯為特異性識別位點。該探針在室溫的可見光激發(fā)下即可顯示出高效的磷光發(fā)射，使其對生物體的損害降至最低，由于探針和過氧化氫反應(yīng)可引起特異性硼酸降解，其對過氧化氫的選擇性優(yōu)于其它活性氧，為設(shè)計對過氧化氫特定識別位點的熒光探針提供了理論依據(jù)。

Velusamy 等［2］基于香豆素和萘酰亞胺的結(jié)合設(shè)計了檢測外源性和內(nèi)源性H2O2與H2S 的雙通道熒光探針。該探針無毒，可用于癌細(xì)胞標(biāo)記，在癌癥診斷方面具有潛在應(yīng)用價值。

Han 等［3］設(shè)計出一種同時檢測H2O2與HClO的熒光探針，可作為研究H2O2與HClO 在氧化應(yīng)激中相互作用的工具。

Zhang 等［4］以4-二乙胺水楊酸為原料，經(jīng)6 步法合成檢測過氧化氫的熒光探針，該探針已經(jīng)成功用于細(xì)胞腔內(nèi)單光子顯微鏡和雙光子顯微鏡成像。

2 檢測一氧化氮

一氧化氮（NO）是人體內(nèi)重要的內(nèi)源性物質(zhì)，是目前所知最強的血管舒張因子和收縮因子，其作用極其廣泛，它可作為介質(zhì)、信使或細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子參與機體許多生理與病理過程，并與部分疾病的發(fā)生相關(guān)，因此監(jiān)測活細(xì)胞中的一氧化氮含量對深入探究一氧化氮的作用機制至關(guān)重要。

Han 等［5］報道了基于香豆素的熒光探針，用于生物系統(tǒng)中的一氧化氮檢測，以香豆素為信號單位，氨基硫脲為識別單位，在一氧化氮存在的情況下，探針FP–NO 與一氧化氮快速選擇性反應(yīng)，產(chǎn)生的FP–P 具有高熒光，從而間接檢測一氧化氮，一氧化氮檢出限為47.6 nmol／L。FP–P 兼具生物相容性和活細(xì)胞膜通透性，用于MCF–7 細(xì)胞外源性一氧化氮和炎癥J774A 細(xì)胞外源性一氧化氮的成像和流式細(xì)胞術(shù)分析，實現(xiàn)了活斑馬魚外源性和內(nèi)源性NO 生產(chǎn)的可視性，為研究活生物體中一氧化氮作用機理提供理論依據(jù)。

Zhang 等［6］設(shè)計合成出兩種一氧化氮探針，分別為尼羅紅的對苯二胺衍生物和香豆素的鄰苯二胺衍生物，后者可同時作為良好開關(guān)型NO 熒光探針及雙光子熒光探針的熒光團。該課題組開發(fā)的具有良好組織型纖溶酶原激活物（TPA）活性的一氧化氮探針，為構(gòu)建更多基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移原理（PET）的無響應(yīng)雙光子熒光傳感器提供了結(jié)構(gòu)–性能關(guān)系的理論基礎(chǔ)。

Sadek 等［7］設(shè)計出一種檢測巨噬細(xì)胞中NO 的熒光探針，該探針與NO 能夠進行特異性反應(yīng)，可作為細(xì)胞成像的潛在工具。

Wang 等［8］合成出對NO 具有高選擇性和靈敏性的熒光探針，已成功用于水溶液中NO 的熒光檢測。

3 檢測次氯酸離子

次氯酸是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的毒性最強、豐度最高的強氧化劑，可快速攻擊包括硫醇、硫醚、胺類、氨基酸、核苷酸、抗壞血酸和多烯酸等多種生物分子。同時，次氯酸與雙氧水和超氧陰離子反應(yīng)可分別生成單線態(tài)氧和羥基自由基，而單線態(tài)氧和羥基自由基是檢驗活細(xì)胞功能正常與否的重要標(biāo)志。

Wang 等［9］設(shè)計合成出一種以香豆素衍生物作為熒光團、二甲基氨基甲硫基氯和硫化物作為調(diào)制器的熒光探針，該探針對次氯酸選擇性好，響應(yīng)性能顯著，能夠在60 s 內(nèi)對溶液中的次氯酸作出反應(yīng)，檢測下限為34.75 nmol／L，表明該熒光探針可以用來定性檢測活細(xì)胞中不同濃度的次氯酸，以及自來水中的次氯酸。

Shangguan 等［10］開發(fā)了基于香豆素染料和丙二腈的熒光探針，該熒光探針用于檢測環(huán)境中的次氯酸根離子和活細(xì)胞中的氯離子，其檢測波長為459 nm，檢測限為5.7 nmol／L，檢測時間小于15 s。該熒光探針工作機制為碳碳雙鍵被氯氧化生成醛，三坐標(biāo)測量機探針（CMM）位上的取代基雙鍵被氧化成醛，在與次氯酸根離子反應(yīng)時產(chǎn)生一個與甲酰香豆素(［m+Na］+)相對應(yīng)的新峰m／z227.031 2，表明探針CMM 向醛的產(chǎn)物發(fā)生了轉(zhuǎn)化，得到較強熒光。該探針對環(huán)境水樣中的氯離子定量測定具有較高的準(zhǔn)確度，已成功用于檢測MDA–MB–231 細(xì)胞中的氯離子。

Tang 等［11］合成了用于檢測生物體內(nèi)氯離子和銅離子的雙功能香豆素?zé)晒馓结?1，該探針對ClO–與Cu2+的檢出限分別為24.62 nmol／L 和0.39 nmol／L，檢測時間分別為5 s和30 s。其檢測原理是：ClO–與Cu2+使探針8 位上的C—N 鍵氧化斷裂成C—O 鍵，從而引起顏色變化，ClO–顏色由黃色變?yōu)闊o色，Cu2+由黃色變?yōu)榱咙S色。該探針對ClO–、Cu2+均表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏性，研究表明，此探針對環(huán)境水樣的檢測具有潛在意義。

4 檢測含硫化合物

4.1 檢測硫化氫

Yang 等［12］報道了檢測活細(xì)胞中硫化氫的α，β-不飽和乙酰香豆素?zé)晒馓结?，該探針具有強熒光特性，與硫化氫發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)致使熒光猝滅，可用于檢測活細(xì)胞中存在的硫化氫，檢出限為5×10–8mol／L，優(yōu)于報道的大多數(shù)檢測硫化氫用熒光探針。

Jin 等［13］設(shè)計合成一種以香豆素為母核的3-(E)-3-(1H-吲哚-3-基)丙烯酰-2H-鉻酮-2-1 探針，用于快速檢測水溶液中的硫化氫，其檢出限為3.3×10–8mol／L。該探針顯示出低細(xì)胞毒性，在活細(xì)胞中與硫化氫的成像表現(xiàn)為紅色熒光顯著增強。

Zaorska 等［14］報道一種檢測硫化氫的熒光探針4-甲基-2-氧基-2-H-色氨酸-7-基-5-疊氮戊酸鹽，其對生理pH 條件下的磷酸鈉緩沖液和唾液中硫化氫的檢測具有高度的靈敏性，在唾液中硫化氫的檢出限達(dá)到微摩爾數(shù)量級。

4.2 檢測二氧化硫

作為機體的內(nèi)源性物質(zhì)之一，二氧化硫參與多種生理調(diào)節(jié)，其濃度異常會導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，開發(fā)簡便、快速識別二氧化硫在生物體內(nèi)變化的熒光探針至關(guān)重要。

Song 等［15］以香豆素和苯并吡喃熒光團為基礎(chǔ)，構(gòu)建出線粒體靶向比率熒光探針，用于檢測活細(xì)胞中的二氧化硫。該探針有強烈的藍(lán)色和紅色熒光，快速響應(yīng)二氧化硫后，在433 nm 下熒光明顯增強，在683 nm 下熒光明顯減弱。活斑馬魚體內(nèi)成像實驗表明，該探針具有組織通透性，對二氧化硫有較高的靈敏度和選擇性，可在生物體內(nèi)的兩個發(fā)射通道檢測二氧化硫，目前已經(jīng)成功用于活細(xì)胞和斑馬魚線粒體中二氧化硫的檢測。

Kong 等［16］合成出一種新型香豆素類比色熒光探針，在近紅外和雙光子雙模下用于二氧化硫的檢測。該探針具有穩(wěn)定性好、選擇性高、響應(yīng)速度快(10 s)、Stokes 位移大、檢測限低等優(yōu)點，且具有近紅外發(fā)射、雙比色和熒光檢測能力。研究表明該探針是探索生物體內(nèi)二氧化硫生理和病理活動的有效分析工具。

Xu 等［17］報道了一種親脂性陽離子染料檢測內(nèi)源性SO2衍生物，成功用于HeLa 細(xì)胞內(nèi)二氧化硫衍生物的檢測。

5 檢測細(xì)胞結(jié)構(gòu)

5.1 檢測半胱氨酸

Wang 等［18］設(shè)計合成了一種檢測同型半胱氨酸的香豆素二聚體熒光探針，該探針具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點。

Chen 等［19］設(shè)計出一種溶酶體靶向半胱氨酸熒光生物傳感器，在生理條件下可對半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽等多種天然氨基酸產(chǎn)生熒光啟動反應(yīng)，在520 nm 處熒光顯著增強，已成功用于小鼠器官組織和HeLa 細(xì)胞的L-半胱氨酸（Cys）熒光成像。該探針對溶酶體內(nèi)的半胱氨酸具有靶向性，而且具有生物相容性，可作為蛋白質(zhì)標(biāo)記物或疾病監(jiān)測工具。

Ma 等［20］將識別單元2，4-二硝基苯磺酰基酯和香豆素衍生物相結(jié)合，開發(fā)了一種用于檢測半胱氨酸的新型熒光探針，該探針對半胱氨酸有高選擇性，可在水基緩沖液中與半胱氨酸反應(yīng)，有良好的水溶性和生物相容性，其檢出限為23 nmol／L，已經(jīng)成功用于活細(xì)胞中半胱氨酸的成像。

5.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成像

Wijesooriya 等［21］合成兩種含有磺胺側(cè)基的香豆素類化合物用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成像。該類化合物對HeLa 和GM 07373 哺乳動物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有選擇性，且對這些細(xì)胞的毒性較低，IC50值為205～252 μmol／L。研究表明，以香豆素為基礎(chǔ)的探針更適用于發(fā)出黃色和紅色熒光的多色成像，而且在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記，在細(xì)胞成像應(yīng)用中具有通用性。

5.3 檢測線粒體

Qi 等［22］設(shè)計合成兩種香豆素／熒光融合熒光染料，這些染料很容易引入其它基團來設(shè)計不同的功能分子，并且這些染料對pH 值在4.0～7.4 范圍內(nèi)的反應(yīng)是快速而靈敏的，表明這兩種染料不僅具有良好的細(xì)胞膜通透性和較低的細(xì)胞毒性，而且能夠快速監(jiān)測活細(xì)胞線粒體pH 變化。

5.4 檢測脂滴

脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂類(包括甘油三酯和膽固醇酯)的主要儲存場所，其功能障礙會導(dǎo)致糖尿病、肥胖癥、動脈粥樣硬化等多種疾病。

Chen 等［23］以2-氨基芳基酮和3-乙酰-7-二乙胺香豆素為原料，利用Friedlander 法合成兩種喹諾酮–香豆素衍生物，這兩種衍生物光穩(wěn)定性好，在弱酸至堿性溶液中均具有較強的熒光性，且具有較高的熒光量子產(chǎn)率（0.79～0.96），合成的衍生物可以作為活細(xì)胞和細(xì)胞中脂滴的標(biāo)志物。

6 檢測毒性物質(zhì)

6.1 檢測肼

肼是一種常用的化學(xué)還原劑，對人體和環(huán)境具有高毒性。Shi 等［24］以雙乙酰氧基為反應(yīng)位點，設(shè)計合成了一種用于檢測肼的雙乙酰氧基類熒光探針，檢測下限為2.98 nmol／L，檢測速度較快(10 min)，該探針可用于蒸餾水中肼以及HepG–2 人肝癌細(xì)胞的檢測。

6.2 檢測氰化物

氰化物對生物體的毒性巨大，極少量即可導(dǎo)致生物死亡，原因是氰化物在細(xì)胞色素中與氧化酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制酶的活性，阻斷細(xì)胞獲得氧，導(dǎo)致細(xì)胞窒息，因此開發(fā)一種檢測氰化物的方法至關(guān)重要。

Sun 等［25］設(shè)計合成一種新型香豆素查爾酮衍生物熒光探針，用來識別CN–和生物硫醇，其優(yōu)點是具有良好的靈敏度、選擇性以及抗干擾性。該探針存在兩個親核加成位點，香豆素1 位上與CN–發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，在4 位上也發(fā)生CN–加成，邁克爾加成法將CN–及生物硫醇與探針的碳碳鍵結(jié)合，阻斷了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致吸收峰降低和熒光猝滅。

7 展望

香豆素類衍生物是天然藥物化學(xué)中的一類重要化合物，具有明顯的抗凝血、抗腫瘤以及抗人類免疫缺陷病毒的生物活性，同時香豆素及其衍生物具有很好的光學(xué)性能，其熒光量子產(chǎn)率高，Stokes 位移大，溶解性好，光穩(wěn)定性強，能夠廣泛應(yīng)用于熒光探針領(lǐng)域。以香豆素為母體合成的熒光探針已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物和環(huán)境領(lǐng)域，可檢測重金屬離子、含硫化合物、活性氧、蛋白質(zhì)以及監(jiān)測細(xì)胞結(jié)構(gòu)等。目前，香豆素類熒光探針主要存在合成成本高、合成路線復(fù)雜、污染環(huán)境等問題。綜上所述，基于香豆素母核為熒光發(fā)射團，尋找一些新的合成位點、識別位點和作用機制，設(shè)計出一系列具有高選擇性、高靈敏性、操作簡單、光穩(wěn)定性好、溶解性好、無毒或低毒類的熒光探針是今后的研究方向。