環(huán)狀RNA 功能及其在糖尿病和糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展

李珍瑾，周賽君，郭建超

1 天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院內分泌科，天津300211；2 天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院腎病透析科

糖尿病是一組因胰島素絕對或相對分泌不足和（或）胰島素利用障礙引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。根據國際糖尿病聯(lián)盟2019年統(tǒng)計數(shù)據顯示，全球約有4.63 億糖尿病患者，中國糖尿病患者人數(shù)排名第一，約為1.164億人［1］。糖尿病可引起多系統(tǒng)損害，包括眼、腎、神經、心臟、血管等組織器官的慢性進行性病變、功能減退，甚至衰竭，從而危及患者生命。環(huán)狀RNA（circRNA）是由mRNA 前體（premRNA）反向剪接形成的共價閉合環(huán)形RNA 分子，且高度穩(wěn)定、進化保守，在真核生物中廣泛分布。越來越多的證據［2］表明，circRNAs 失調是包括肥胖、高血壓和心血管疾病在內的各種代謝紊亂的最初改變之一。研究［3］顯示，circRNA 參與心血管系統(tǒng)疾病、神經系統(tǒng)疾病、內分泌系統(tǒng)疾病和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。最近的研究［4］表明，circRNAs在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制中也起著重要作用。深入研究circRNA 在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用，有助于更好地了解疾病的發(fā)生機制，探尋生物學標志物和潛在治療靶點?，F(xiàn)將circRNA 功能及其在糖尿病和糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展綜述如下。

1 circRNA的功能

circRNA 是一種內源性非編碼RNA（ncRNA），由premRNA 反向剪接而成，即將下游5′端剪接位點與上游的3′端剪接位點通過共價鍵連接形成環(huán)狀結構，不具有5′端的甲基鳥苷（m7GpppN）帽子結構和3′端的多聚腺苷酸（polyA）尾，不易被核酸外切酶降解，表達也比線性RNA 更加穩(wěn)定，故在血清外泌體中有成為新型生物學標志物的潛力。circRNA 由不同的序列和域組合而成，可以分為外顯子cir?cRNA（ecRNA）、內含子circRNA（ciRNA）和外顯子-內含子共同組成的circRNA（ElciRNA），以及一些在轉運RNA（tRNA）前剪接過程中產生的circRNA（tri?cRNA）。與線性RNA 的標準剪切模式不同，cir?cRNA 是通過反向剪接環(huán)化形成，目前提出了4種模型來闡明其形成機制［5］：①直接反向剪接，又稱為內含子配對驅動模型，在pre-mRNA 中兩個相鄰的內含子通過堿基反向互補配對形成circRNA；②外顯子跳躍，即套索驅動模型，外顯子跳躍形成套索結構，將切除的套索結構通過反向剪接形成circRNA；③RNA 結合蛋白（RBP）介導的模型，RBPs 可以將兩個側面的內含子連接起來，移除內含子后形成cir?cRNA；④內含子環(huán)化形成模型，5′端剪接位點富含的鳥嘌呤G、尿嘧啶U 與3′端分支位點的胞嘧啶C核苷酸序列共同構成保守序列，可避免內含子套索結構被降解，從而形成完整的circRNA。由于cir?cRNA 序列與同源線性RNA 序列相似，因此如何證明circRNA 的功能目前仍然是一個挑戰(zhàn)。隨著生物測序技術的發(fā)展，circRNA 的一些功能已被探知，其在轉錄或轉錄后基因表達調控方面發(fā)揮著重要作用。

1.1 通過海綿作用吸附微小RNA（miRNA）來調控mRNA miRNA 是一類具有調控作用的非編碼RNA，其能通過與靶mRNA 結合或引起靶mRNA 的降解而影響基因的表達［6］。circRNA 含有miRNA 結合位點，可作為競爭性內源性RNA，通過海綿作用有效吸附miRNA，從而調控miRNA 的靶基因。研究［7］顯示，circRNA 小腦變性相關蛋白1 反義轉錄物（CDR1as）含74 個miRNA7 結合位點，可充當miR?NA-7 海綿，調節(jié)miRNA-7 靶mRNA 的表達水平；進一步研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as 不能被RNA 誘導沉默復合物（RISC）降解，而RISC 是由miRNA-7 介導的，可以補充miRNA-671 的降解。然而，并不是所有cir?cRNA 都具有海綿吸附調控mRNA 的作用。有研究［8］發(fā)現(xiàn)，來自同源域相互作用蛋白激酶3（HIPK3）基因外顯子2 的circHIPK3 可作為多種miRNA 的“海綿”。

1.2 與RBPs 相互調控 RBPs 是RNA 轉錄后調控的關鍵，參與RNA 的成熟、轉運、定向和翻譯。越來越多的研究［9］表明，RNA 聚合酶Ⅱ等RBPs 可與cir?cRNA 結合，影響circRNA 的剪接、折疊、穩(wěn)定、加工和定位，circRNA 還可以作為RBP 的“海綿”起到基因表達轉錄后調節(jié)器的作用，例如circRNAs與RISC的Argonaute 蛋白（AGO）相互作用，調節(jié)miRNA 起作用。有研究［10］發(fā)現(xiàn)，circPABPN1 通過結合RBP 人抗原R（HuR）來阻斷HuR 與PABPN1 mRNA 的相互作用，從而導致mRNA 的翻譯率低。此外，還有研究［11］表明，在血管平滑肌細胞和巨噬細胞中，INK4基因座（circANRIL）中的環(huán)狀反義非編碼RNA 與pescadillo 同源物1 的c-末端結構域結合，該結構域是一種重要的60S 前核糖體組裝因子，從而減弱了核酸外切酶介導的前rRNA 加工和核糖體合成。由此可見，circRNA 與RBPs 的相互調控在調節(jié)疾病過程的不同方面的有潛在作用。

1.3 調控基因轉錄 盡管大部分circRNAs 主要位于細胞質中，但位于細胞核內的ElciRNA 被認為參與了調控基因轉錄的過程，以促進其親本基因表達。研究［12］顯示，來源于錨蛋白重復結構域52 基因內含子的circRNA（ci-ankrd52）和沉默信息調節(jié)因子7 circRNA（ci-sirt-7）能夠通過與RNA 聚合酶Ⅱ延伸復合物的相互作用，分別增強其親本基因ankrin52和RIRT7 的表達。還有研究［13］證實，真核細胞翻譯起始因子3J circRNA（ElciEIF3J）和多聚（A）結合蛋白相互作用蛋白2 circRNA（ElciPAIP2）屬于外顯子-內含子circRNA，可通過與U1 小核核糖核蛋白（sn?RNP）結合形成ElciRNA-U1 snRNP 復合體，該復合體結合RNA 聚合酶Ⅱ發(fā)揮順式調控作用，從而促進其基因的轉錄，而ElciEIF3J 和ElciPAIP2 的大量減少也降低了EIF3J 和PAIP2 的轉錄水平。此外，cir?cRNA 的形成和pre-mRNA 剪接成線性RNA 的過程都需要一個共同的外顯子，這兩個過程形成競爭，可中斷mRNA的剪切調控，影響mRNA的表達。

1.4 參與蛋白質翻譯 以往觀點認為，circRNA 由于沒有5′端帽子和3′端的polyA 尾結構是不能翻譯的。而近些年研究［14］顯示，一小部分circRNA 具有內部核糖體進入位點（IRESs），可以參與蛋白質翻譯，例如與多聚核糖體相關的circZNF609 可以一種非依賴于5′端帽子結構的方式進行翻譯。在果蠅的大腦中，有些circRNAs 是可以翻譯的，這表明核糖體相關的circRNA 的非翻譯區(qū)（UTR）允許沒有5′端帽子結構也能夠進行翻譯。N6 甲基腺苷（m6A）RNA 的修飾有效地觸發(fā)了circRNAs 向蛋白質的轉化，m6A 共有基序在circRNAs 中豐富，而單個m6A位點就足以驅動翻譯起始。circRNA 能否直接翻譯是一個有爭議的問題，例如在大腸桿菌細胞中，長度為126 個核苷酸的circRNA 可以有效地轉化為蛋白質。最近的研究［15］表明，一些circRNAs 可以在細胞中轉化為短肽，盡管有時表達水平較低，但它們仍發(fā)揮著關鍵作用。而從circRNAs 中提取的編碼多肽是否具有生理功能尚待研究。

1.5 產生假基因 一項研究［16］表明，circRNA 也可作為反轉錄的轉座子，并且加工后產生的假基因可被插入到宿主基因組，所以來源于circRNA 的假基因使得circRNA 獲得一個新功能：通過插入其轉錄產物來改變基因組DNA 合成。但盡管有這些發(fā)現(xiàn)，目前對于假基因的功能和機制仍不清楚。

2 circRNA 在糖尿病和糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1 circRNA 在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用 cir?cRNA 的高度穩(wěn)定性、特異性和敏感性，以及較低的檢測成本，使其可成為糖尿病診斷和預測的潛在生物學標志物［3］。通過微陣列分析2 型糖尿病（T2DM）和健康受試者的外周血circRNA 水平，篩選有差異性表達的circRNA，驗證后發(fā)現(xiàn)cir?cRNA0054633（has_circ_0054633）可作為糖尿病前期和T2DM 的診斷生物學標志物。進一步研究［17］表明，circRNA0054633 通過miRNA-218/環(huán)形交叉軸突導向受體同源物1（Robo1）和miRNA-218/血紅素加氧酶1（HO-1）通路來調控高糖誘導的血管內皮細胞功能障礙，這可能與糖尿病的發(fā)病機制有關。在妊娠期糖尿病（GDM）患者中，circRNA0054633 與母體血樣本（包括胎盤組織和臍血）糖化血紅蛋白水平高度相關，在妊娠中期、晚期、胎盤及臍血中具有診斷價值，與circRNA-103410 在妊娠晚期和新生兒臍血中有很強的相關性［18］。還有研究［19］發(fā)現(xiàn)，circ-5824、circ-3636和circ-395在GDM 中表達下調，可能參與了晚期糖基化終產物受體信號通路。高糖可以誘導與心血管疾病生化特性相關的血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖。CHEN 等［20］發(fā)現(xiàn)，通過微陣列分析高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)人VSMCs 的circRNA 水平，cir?cWDR77 是上調最顯著的轉錄物，提示circWDR77可能是糖尿病慢性并發(fā)癥的生物標志物。

胰島β 細胞功能受損是T2DM 發(fā)病的主要原因，CDR1as作為miRNA-7抑制劑，通過吸附miRNA-7，增強肌球蛋白VⅡA 與Rab 相互作用蛋白（Myrip）和盒蛋白（Pax6）基因表達，促進胰島β 細胞增殖和胰島素分泌，從而使胰島β 細胞功能得到全面改善。事實上，過表達miRNA-7a 的轉基因小鼠由于胰島素分泌受損和胰島β 細胞去分化而易誘發(fā)糖尿病。STOLL 等［21］檢 測 糖 尿 病 模型 小 鼠胰 島β 細胞 中CDRlas 和circHIPK3 的表達均減少，沉默這兩種cir?cRNA會導致胰島素分泌缺陷、胰島β細胞增殖能力降低和存活率下降，這表明circHIPK3 和CDRlas 表達改變可能在糖尿病的發(fā)生中起作用。同樣，CAO等［22］發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者的主動脈內皮細胞（HAECs）和高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞（HU?VECs）中，circHIPK3 的表達顯著降低。因此，CDR?las和circHIPK3可能是糖尿病的潛在治療靶點。

2.2 circRNA在糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的作用

2.2.1 circRNA 在糖尿病心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用 糖尿病心腦血管疾病是糖尿病患者死亡和致殘的首要原因。circRNAs 被證明能影響血糖升高、炎癥和脂質積聚，這些都會對血管產生不良影響，并可導致內皮功能障礙和心血管疾?。–VD）的發(fā)展。研究［11］顯示，circANRIL 與動脈粥樣硬化風險降低密切相關。有證據［23］表明，circRNA ZFAS1和CDR1as 表達的變化可以預測急性心肌梗死，has_circRNA11783-2 與T2DM 患者冠狀動脈疾病的發(fā)生關系密切。還有研究［24］發(fā)現(xiàn)，在T2DM 患者外周血細胞中，circANKRD36表達顯著上調，并與炎癥因子相關，由于血管炎癥是糖尿病和CVD 的重疊危險因素，因此circANKRD36 可以作為糖尿病患者炎癥性心血管疾病發(fā)展的生物學標志物。糖尿病是腦血管疾病的重要危險因素，在急性缺血性腦卒中患者的血漿中circDLGAP4表達下調，與疾病嚴重程度、炎性細胞因子表達和促炎基因miRNA-143 表達呈負相關［25］。糖尿病性心肌?。―CM）是指發(fā)生在糖尿病患者，在沒有冠心病、高血壓等其他心臟危險因素的情況下，心臟結構和功能發(fā)生異常的一種疾病。研究［26］發(fā)現(xiàn)，circRNA 與DCM 的發(fā)生密切相關。TANG 等［27］發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠心肌中以及血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心肌成纖維細胞中，circRNA-000203 的表達顯著增加，這可能成為預防和治療DCM 心肌纖維化的潛在靶點。有研究［28］發(fā)現(xiàn)，cir?cRNA-010567 在糖尿病小鼠心肌中表達顯著上調，其可通過miRNA-141/轉化生長因子β1（TGF-β1）途徑 促 進 心 肌 纖 維 化。最 近，YANG 等［29］研 究 證明，hsa_circ_0076631（CACR）在高糖環(huán)境下的人心肌細胞和糖尿病患者的血清中高表達，CACR 可通過靶向miRNA-214/caspase-1 通路來介導DCM 細胞凋亡。

2.2.2 circRNA 在糖尿病視網膜病變（DR）發(fā)生發(fā)展中的作用 DR 是糖尿病微血管的主要并發(fā)癥之一，且是導致視力下降和失明的主要原因之一，高血糖、高血壓、血脂異常和糖尿病病程長是DR 微血管功能障礙的危險因素和主要原因。ZHANG等［30］研究發(fā)現(xiàn)，circ_0005015 在DR 患者的血漿、玻璃體和纖維血管膜中表達顯著上調，siRNA 介導的circ_0005015 沉默能夠顯著降低人視網膜血管內皮細胞增殖、遷移和血管形成。SHAN 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3 在糖尿病視網膜功能障礙中起著重要作用，可作為內源性miRNA-30a-3p海綿促進內皮細胞增殖和血管功能異常，沉默circHIPK3 可以減弱毛細血管滲漏和炎癥，從而改善視網膜血管功能障礙。還有研究表明，過表達circZNF609 能夠通過增加白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的分泌而促進炎癥反應，加重DR 小鼠的血管滲漏和毛細血管變性；circZNF609 沉默可減少視網膜血管丟失、抑制病理性血管生成，以避免高糖和缺氧應激損傷。此外，circRNA-cPWWP2A 能通過抑制miR?NA-579 上調相關靶基因血管生成素1、緊密連接蛋白和沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1）的表達，從而減輕糖尿病引起的視網膜血管功能障礙［32］。

2.2.3 circRNA 在糖尿病腎?。―N）發(fā)生發(fā)展中的作用 DN是另一種主要的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病的首要原因。HU 等研究［33］發(fā)現(xiàn)，circ_15698 在db/bd 小鼠和高糖誘導的小鼠系膜細胞中表達上調，circ_15698 通過吸附miRNA-185 增加TGF-β1水平，促進細胞外基質（ECM）相關蛋白的合成。CHEN 等［34］研究報道了在高糖條件下上調的circLRP6 通過miRNA-205 來影響系膜細胞的損傷，circLRP6 可調控高糖誘導的增殖、氧化應激、ECM積累和炎癥，同時能激活Toll 樣受體4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）通路參與DN 的進展。最近研究［35］顯示，circ_008045 的表達與DN 的進展呈正相關，在系膜細胞中其可通過miR-24-3p 海綿作用抑制細胞增殖和纖維蛋白產生。

2.2.4 circRNA 在糖尿病神經病變（DNP）發(fā)生發(fā)展中的作用 DNP 是最常見的糖尿病并發(fā)癥之一，涉及外周神經和自主神經，影響超過50%的糖尿病患者，包括miRNAs、circRNAs 在內的ncRNAs 均在DNP 的發(fā)病機制中起著重要作用。WANG 等研究［36］發(fā)現(xiàn)，circHIPK3 在患有糖尿病神經痛的糖尿病患者血清和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的背根神經節(jié)中表達顯著增加，鞘內注射circHIPK3shRNA 可以緩解糖尿病大鼠的神經性疼痛，其機制可能是circHIPK3 通過負向調節(jié)miRNA-124 的表達發(fā) 揮 作 用。LIU 等［37］研 究 了 自 噬 相 關circRNA（ACR）對高糖刺激大鼠雪旺RSC96 細胞（作為DNP的體外模型）的影響，發(fā)現(xiàn)ACR 能夠通過下調miR?NA-145-3p 來減輕RSC96 細胞的凋亡、自噬和氧化應激。

綜上所述，circRNAs 可調節(jié)胰島β 細胞的功能參與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展，也可作為糖尿病診斷和預測的潛在生物學標志物，并與糖尿病大血管病變、微血管病變等并發(fā)癥均有關。將circRNAs與臨床、遺傳學、表觀遺傳學和經典標記物結合起來，有助于指導糖尿病患者的醫(yī)療決策，尤其是在精確醫(yī)學方面。由于circRNAs 是一個相對較新的研究領域，circRNAs 的細胞特異性和組織特異性，以及在活檢和外泌體中高穩(wěn)定性，使其有希望成為下一代糖尿病治療的藥物。與其他治療方法一樣，circRNAs 作為藥物也可能引起不必要的不良反應、改變藥物的敏感性或引起耐藥性。在未來幾年里，我們對circRNA 調控網絡的理解將不斷加深，新的生物學角色可能會出現(xiàn)，這將為建立基于circRNA 的治療方法和促進其發(fā)揮作用奠定更堅實的基礎。