外泌體分離、表征方法及其在環(huán)境毒理學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

董平軒，崔淑芹，楊朝，尹文英，朱俊宇，童明瓊

德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東德州253023

1983年，JOHNSTONE等［1］在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞上清液中首次發(fā)現(xiàn)囊泡狀結(jié)構(gòu)，并將其命名為exosome，即外泌體［2］。外泌體是一類由細(xì)胞分泌的直徑30～150 nm脂質(zhì)雙分子層囊泡，膜內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂類、mRNA、miRNA和代謝物等［3］。外泌體密度介于1.13～1.21 g/cm3，最早形成于細(xì)胞胞吞形成的早期內(nèi)體，早期內(nèi)體再內(nèi)凹形成管腔內(nèi)囊泡，管腔內(nèi)囊泡進(jìn)一步形成多泡小體，多泡小體與細(xì)胞膜融合被分泌出去，形成外泌體［3-4］。幾乎所有細(xì)胞都能產(chǎn)生外泌體，外泌體可從各種體液和腫瘤等實(shí)體組織中分離出來［4］。研究［4］顯示，外泌體參與免疫反應(yīng)、病毒感染、心腦血管疾病和癌癥等生理病理過程。VALADI等［5］發(fā)現(xiàn)，鼠肥大細(xì)胞分泌外泌體將其攜帶的mRNA傳遞給人肥大細(xì)胞，并翻譯成蛋白質(zhì)。外泌體還通過其攜帶的mi RNA調(diào)節(jié)靶細(xì)胞mRNA水平。研究［6］發(fā)現(xiàn)，外泌體通過其攜帶的調(diào)節(jié)神經(jīng)回路發(fā)育信號(hào)分子，使受疾病影響的腦細(xì)胞恢復(fù)正常。近期研究［7］顯示，來自新冠病毒肺炎（COVID-19）重癥患者肺細(xì)胞外泌體參與了病毒侵染和免疫逃逸過程。外泌體成分反映了供體細(xì)胞的狀態(tài)，因此分析外泌體可實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥等疾病的早期診斷［4］。外泌體還因其毒性低、無免疫原性和滲透力好等優(yōu)勢(shì)，在miRNA、抗體和化療藥物等藥物遞送中具有巨大應(yīng)用潛力［4］。在環(huán)境污染物的毒性和機(jī)理研究中，外泌體及其內(nèi)含物也被作為生物標(biāo)志物或用于闡釋致病機(jī)理的模型。因此，需要開發(fā)簡單、快速、高通量且不破壞外泌體結(jié)構(gòu)的分離方法和更準(zhǔn)確的表征方法，有利于其后期功能研究和應(yīng)用。本研究就外泌體分離和表征方法及其在環(huán)境毒理學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為探索外泌體環(huán)境污染物毒性及其毒性機(jī)制研究領(lǐng)域的潛在應(yīng)用提供思路。

1 外泌體的分離方法

依據(jù)外泌體密度、大小和所含標(biāo)志蛋白等特性，產(chǎn)生了不同的外泌體分離方法，包括超速離心法、聚合物沉淀法、免疫捕獲法、尺寸排阻色譜法、超濾法和微流控技術(shù)法等［8］。外泌體的分離存在許多難點(diǎn)，一是外泌體來源的異質(zhì)性和復(fù)雜性；二是方法的可擴(kuò)展性和通量，如臨床治療用的外泌體需要符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的大規(guī)模外泌體的提取方法［9］；三是樣品收集、處理和保存的指導(dǎo)原則/標(biāo)準(zhǔn)的建立，以保障研究的可重復(fù)性和臨床應(yīng)用［8］。開發(fā)回收率高、高特異性和高通量的分離方法是外泌體分離的未來發(fā)展趨勢(shì)。

1.1 超速離心法 超速離心又稱為差速離心，是一種基于外泌體的密度和尺寸的分離方法，最高離心力通常選擇100 000～120 000×g。JOHNSTONE早期分離外泌體也是采用此法。THERY等［9］對(duì)從細(xì)胞上清、尿液、血清及腹水等體液中差速離心分離外泌體進(jìn)行了總結(jié)。先經(jīng)300×g、2 000×g、10 000×g低速和高速離心去除細(xì)胞、死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，再經(jīng)4℃超高速100 000～120 000×g離心，獲得沉淀，PBS重懸后，再次超高速100 000×g離心沉降外泌體以去除雜蛋白。此方法比較成熟，處理較大容量的樣本，應(yīng)用范圍廣，因此成為使用頻率最高的一種分離方法［11］。但也存在外泌體純度不高，需要投入昂貴的設(shè)備等缺點(diǎn)。超速離心得到的樣品可通過密度梯度離心提高分離外泌體的純度［12］。密度梯度離心的介質(zhì)主要是蔗糖、碘海醇和碘克沙醇等［10］。密度梯度離心法操作復(fù)雜，對(duì)操作者技術(shù)要求較高、通量不高、耗時(shí)較長，且不易去除血液樣本的脂蛋白和乳糜微粒［8］。

1.2 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法依據(jù)聚合物降低外泌體的溶解性易于沉淀來純化外泌體，可以提取血液、腦髓液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等樣本的外泌體，通常使用聚乙二醇（PEG）。許多商品化試劑盒是基于聚合物沉淀原理分離外泌體。用Invitrogen、101Bin和Wako等試劑盒和傳統(tǒng)的超速離心法提取外泌體，結(jié)果顯示不同試劑盒分離外泌體的產(chǎn)率不同［13］。鄭程峰等［14］用試劑盒分離人牙髓細(xì)胞外泌體的產(chǎn)率比差速離心法高，但含有雜質(zhì)。聚合物沉淀法有簡單、快速且無需使用昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。但商品化試劑盒價(jià)格昂貴，純化過程中易受到聚合物污染影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)［8］。

1.3 免疫捕獲法 CD63、CD9、CD81和ALIX等外泌體表面的膜蛋白可與相應(yīng)抗體產(chǎn)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)外泌體的提取。商業(yè)化試劑盒（Exo-Flow）基于此分離外泌體［8］。NAKAI等［15］利用小鼠T淋巴細(xì)胞膜蛋白（Tim4）和外泌體表面磷脂酰絲氨酸的特異性結(jié)合分離純化外泌體。免疫捕獲法有特異性強(qiáng)、能有效減少蛋白質(zhì)等干擾物的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是抗體成本高，通量小等。SAMSONOV等［16］利用凝集素對(duì)外泌體膜上糖類殘基高親和力的特性，從尿液中分離出了外泌體。根據(jù)肝素非特異性結(jié)合多種蛋白的性質(zhì)，BALAJ等［17］從細(xì)胞培養(yǎng)上清和人血漿中提取出了外泌體。這在一定程度上降低了費(fèi)用，但含有較多雜質(zhì)。

1.4 尺寸排斥色譜法 尺寸排斥色譜又稱空間排阻色譜，是根據(jù)分子或顆粒物的尺寸大小進(jìn)行外泌體分離的一種方法。AN等［18］使用尺寸排斥色譜、超速離心法、先超速離心后用尺寸排斥色譜三種方法分離人血清外泌體，結(jié)果顯示，尺寸排斥色譜提取的外泌體蛋白和血清蛋白含量更高，先超速離心后用尺寸排斥色譜提取外泌體可去除血清蛋白。尺寸排斥色譜的優(yōu)勢(shì)是操作簡單、重現(xiàn)性好，處理樣本量大且分離的外泌體大小比較均勻［19］，其缺點(diǎn)是處理樣本時(shí)會(huì)稀釋其濃度，色譜柱不能重復(fù)使用，且費(fèi)用較高。

1.5 超濾法 不同孔徑（0.22μm、0.45μm和0.8μm）超濾膜可以分離不同大小的胞外囊泡和外泌體。超濾法可結(jié)合差速離心分離外泌體，樣品先經(jīng)0.45μm濾膜去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，低溫超速離心獲取沉淀，PBS重懸后再次離心，再經(jīng)0.22μm濾膜除菌得到高純度外泌體。超濾法提取外泌體具有簡單、快速和高效的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是膜的粘附性降低外泌體的產(chǎn)量，過濾時(shí)壓力和剪切力會(huì)使外泌體變形受損，且濾膜容易破損或堵塞影響分離效果［8］。

1.6 微流控技術(shù)法 微流控技術(shù)是一種新興的微尺度分離技術(shù)，是在微流控技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合聲波、介電電泳或微流體黏性等特性發(fā)展起來的，可利用外泌體的大小、密度和黏滯彈性等參數(shù)的差異對(duì)其進(jìn)行分離［20］。此法分離的外泌體具有所需樣本小、檢測(cè)速度快及檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是處理的樣本量小、通量低且樣品處理復(fù)雜。

2 外泌體的表征方法

目前有關(guān)外泌體表征方法的研究較多，目前研究的熱點(diǎn)：一是外泌體表征方法的標(biāo)準(zhǔn)化，二是對(duì)來源受限珍貴樣本（比如手指血、新生兒樣本、淚液樣本等）需開發(fā)高靈敏、信息化多元的定量方法，三是建立特異性、高通量和完整外泌體表征方法以促進(jìn)外泌體的研究和臨床應(yīng)用［8］。目前可通過電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射、納米粒子追蹤分析、流式細(xì)胞儀等對(duì)外泌體的物理形貌和尺寸大小特征進(jìn)行直觀表征或定量分析，對(duì)于其組分如RNA、蛋白質(zhì)和脂類分子等生化特征，則用紫外吸收、電泳、qRT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附、蛋白質(zhì)組學(xué)和脂類組學(xué)等方法進(jìn)行定量表征。

2.1 電子顯微鏡和成像技術(shù)表征法 高分辨率的電子顯微鏡成像是觀察外泌體形貌最常用的選擇。其中，透射電鏡比掃描電鏡使用頻率高。由于對(duì)電鏡圖像中單個(gè)囊泡手動(dòng)分析比較費(fèi)時(shí)，KOTRBOVá等［21］開發(fā)了一種半自動(dòng)軟件工具，它可以分析比周圍環(huán)境更暗的囊泡，并將囊泡與電鏡圖像中的沉淀染色、蛋白質(zhì)聚集體和其他雜質(zhì)區(qū)分出來，但仍無法區(qū)分細(xì)胞外囊泡和脂蛋白顆粒。透射電鏡不提供外泌體濃度信息且觀察視野受限制。SOKOLOVA等［22］用掃描電鏡觀察人胚胎腎細(xì)胞系和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離得到的外泌體。冷凍電鏡可以在冷凍條件下通過電子顯微成像清晰直接地展示出外泌體尺寸、形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且無脫水和染色步驟，對(duì)樣本破壞性小。原子力顯微鏡通過抗CD41抗體功能化硅表面捕獲含有CD41分子的胞外囊泡，檢測(cè)其數(shù)量和粒徑分布，其分辨率可以達(dá)到幾納米，比常規(guī)的流式的分辨率更靈敏。各種電鏡均需要貴重的儀器、成本較高且通量較小。

2.2 動(dòng)態(tài)光散射和納米粒子追蹤分析表征法 動(dòng)態(tài)光散射是基于光譜學(xué)測(cè)定液體基質(zhì)中懸浮顆粒物粒徑分布的方法。動(dòng)態(tài)光散射應(yīng)用在蛋白質(zhì)、外泌體等的粒徑分析上具有簡單、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。但在測(cè)量時(shí)，小顆粒的光強(qiáng)度波動(dòng)信號(hào)會(huì)被大的顆粒遮蓋，所以不適合大小不均勻的異質(zhì)性/多分散性樣本［12］。納米粒子追蹤分析與動(dòng)態(tài)光散射相似，檢測(cè)囊泡粒徑分布的同時(shí)也能檢測(cè)顆粒物濃度［22］，其優(yōu)點(diǎn)是不破壞外泌體的結(jié)構(gòu)、檢測(cè)速度快且樣本制備簡單等，缺點(diǎn)是無法區(qū)分蛋白顆粒和囊泡，檢測(cè)到的濃度偏高。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)表征法 流式細(xì)胞術(shù)用于表征外泌體表面標(biāo)志蛋白、囊泡大小和數(shù)量分布等，也可通過熒光標(biāo)記示蹤外泌體［12］。特異性蛋白染料熒光標(biāo)記后，不需要離心除去未結(jié)合的染料，直接通過流式檢測(cè)結(jié)合熒光標(biāo)記的囊泡。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀分析>200 nm顆粒時(shí)難以準(zhǔn)確測(cè)量外泌體，研究者開發(fā)出納米流式細(xì)胞儀，使用熒光探針的高熒光觸發(fā)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)外泌體和其它細(xì)胞外囊泡的大小和分布。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用量少、快速，兼具高通量和特異性定量分析的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備，且尺寸計(jì)算有誤差。

2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附定量分析表征法 利用紫外可見分光光度法、BCA和電泳對(duì)外泌體總蛋白質(zhì)和RNA含量進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附常用于外泌體表面標(biāo)志蛋白鑒定和定量。常用的外泌體的標(biāo)志蛋白是跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和TSG101、ALIX等多泡小體發(fā)生蛋白［4］。ELISA的優(yōu)勢(shì)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、時(shí)間短（4 h）、通量高（96孔板），但抗原需要兩個(gè)或兩個(gè)以上的抗原表位。Western blot法特異性高，可以同時(shí)檢測(cè)蛋白的分子大小和豐度，但操作繁瑣，耗時(shí)長（>10 h）。兩種方法都依賴抗體，都存在交叉反應(yīng)性的問題［8］。

2.5 微陣列和基于質(zhì)譜的組學(xué)技術(shù)表征法 微陣列（即芯片技術(shù)）可用于研究外泌體DNA/RNA在毒理學(xué)和疾病的分子機(jī)制研究中的作用。其優(yōu)點(diǎn)是通量高，可同時(shí)檢測(cè)上萬條RNA或DNA片段，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，需要qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證或結(jié)合測(cè)序技術(shù)（NGS/RNA-seq）發(fā)現(xiàn)新的有功能RNA/miRNA序列。近年來，基于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜連用（LCMS/MS）的組學(xué)分析逐漸廣泛應(yīng)用于分析外泌體的蛋白質(zhì)組和脂質(zhì)組，可用于特定蛋白質(zhì)、糖蛋白和脂蛋白的確認(rèn)與定量，并進(jìn)一步研究外泌體攜帶貨物分選、疾病和毒理標(biāo)志物篩選等。

3 外泌體在環(huán)境毒理學(xué)中的應(yīng)用

3.1 外泌體作為環(huán)境毒理學(xué)的生物標(biāo)志物 化學(xué)品的暴露會(huì)改變外泌體的分泌及其成分，進(jìn)而影響細(xì)胞周圍的微環(huán)境的改變。BALA等［23］發(fā)現(xiàn)在酒精導(dǎo)致酒精肝動(dòng)物模型中血清外泌體的miR155增加，藥物誘發(fā)的肝損傷則會(huì)明顯增加miR122的含量。ZHOU等［24］發(fā)現(xiàn)尿液外泌體胎球蛋白A的含量在急性腎損傷的動(dòng)物模型和患者中都顯著上升，在不同類型腎損傷尿液外泌體中不同轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)存在差異。LV等［25］發(fā)現(xiàn)腎纖維化患者尿液外泌體miR29明顯高于對(duì)照組。KULKARNI等［26］發(fā)現(xiàn)高劑量離子輻射暴露動(dòng)物后血清和尿液外泌體呈現(xiàn)不同的生物標(biāo)志物。因此，外泌體及其內(nèi)含mi RNA/蛋白可作為化學(xué)品或藥物導(dǎo)致相關(guān)疾病的毒理標(biāo)志物。

3.2 外泌體為環(huán)境污染物暴露相關(guān)疾病的毒性機(jī)制提供模型 環(huán)境污染物如重金屬、殺蟲劑和有機(jī)溶劑等的暴露導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)疾病過程中，外泌體及其內(nèi)含物可能參與這些疾病進(jìn)程，為進(jìn)一步揭示環(huán)境毒理機(jī)制提供依據(jù)。HARISCHANDRA等［27］發(fā)現(xiàn)錳的暴露促進(jìn)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞分泌外泌體，其中miRNA含量增加調(diào)控Tau蛋白聚集、自噬、炎癥等過程，進(jìn)而加快錳導(dǎo)致的帕金森病進(jìn)程。FUJITA等［28］發(fā)現(xiàn)香煙煙氣暴露的支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中miR-210，可在體外促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖分化。這些研究表明外泌體在香煙煙氣導(dǎo)致纖維化和慢性阻塞性肺氣的發(fā)病機(jī)制發(fā)揮重要作用。MUNSON等［29］發(fā)現(xiàn)石棉暴露肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可誘導(dǎo)間皮細(xì)胞癌變。重金屬砷中毒患者血清外泌體miR155含量增加，導(dǎo)致正常干細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而過度炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是為細(xì)胞癌變提供微環(huán)境。LIM等［30］發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)污染物甲苯暴露早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，導(dǎo)致其外泌體多個(gè)miRNA異常表達(dá)，這些miRNA靶基因與癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管和呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)。因此，外泌體及內(nèi)含miRNA可為闡釋環(huán)境污染物誘發(fā)疾病的機(jī)制提供依據(jù)。

綜上所述，外泌體在生理、病理、毒理和臨床治療中發(fā)揮重要作用。目前已有多種外泌體分離和表征方法，但不能滿足研究和臨床需求，因此，需要開發(fā)簡單、快速、高通量且不破壞外泌體結(jié)構(gòu)的分離方法和更準(zhǔn)確的表征方法，有利于其后期功能研究和應(yīng)用。外泌體及內(nèi)含生物分子可作為環(huán)境毒理學(xué)的生物標(biāo)志物，可為今后研究環(huán)境污染物的毒性作用和機(jī)制研究提供模型。