擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化與β-鏈蛋白表達(dá)相關(guān)性的初步分析

朱 慶 趙艷麗 韓麗媛 連國(guó)亮 卜雯婧 陳 東

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心腔(左心室和/或右心室)擴(kuò)大、心肌收縮功能障礙為主要特征的一類有相似表現(xiàn)的心肌疾病，病因不一，且有的病因尚不明。 是導(dǎo)致心力衰竭的較常見疾病之一[1]。 DCM 除心肌細(xì)胞變性外，還常伴有心肌間質(zhì)膠原異常增生和堆積。 膠原增生并將心肌細(xì)胞包繞分隔，嚴(yán)重?fù)p害DCM 的心臟功能。研究認(rèn)為β-鏈蛋白(β-catenin)是Wnt 信號(hào)通路上的重要信號(hào)分子，且與纖維化有緊密關(guān)連[2]。 本研究擬通過(guò)病理形態(tài)觀察及免疫組化技術(shù)檢測(cè)DCM，探討β-catenin 蛋白表達(dá)與心肌纖維化的關(guān)系。

資料與方法

1.病理材料來(lái)源 病例選自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院2015 年至2018 年心臟移植獲得的臨床、超聲、病理診斷為擴(kuò)張型心肌受體心臟(DCM組)和法醫(yī)尸檢獲取的正常心肌對(duì)照，各15 例。DCM 組心肌取自移植心臟左心室灰白區(qū)及灰紅區(qū)心壁，對(duì)照組心肌選自正常心臟左心室心肌，每例取6～10 塊組織。 研究通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。 DCM 組及對(duì)照組組織材料均用10%甲醛充分固定，常規(guī)技術(shù)樣品處理，石蠟包埋，制作成6 μm 切片，再經(jīng)不同染色或免疫組化處理，供不同應(yīng)用。

2.標(biāo)本處理方法 (1) 蘇木素-伊紅染色(HE染色) 切片供觀察心肌的病理形態(tài)特征:并用3DHISTECH 切片掃描儀掃描記錄和觀察其病理形態(tài)特征。

(2)免疫組織化學(xué)染色(IHC)及免疫組化半定量檢測(cè)法研究心肌內(nèi)β-catenin 蛋白的表達(dá):將DCM組及對(duì)照組的切片，加200 μL 封閉液，在室溫下封閉1 h，加入200 μL 的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加酶標(biāo)二抗，在室溫下孵育30 min；經(jīng)蘇木精復(fù)染后封片；用3DHISTECH 切片掃描儀掃描后觀察兩組心肌 內(nèi) β-catenin 蛋 白 的 表 達(dá) 情 況； 在 掃 描 儀CaseViewer 軟件內(nèi)截取400×放大倍數(shù)下IHC 切片內(nèi)DCM 組纖維化區(qū)、非纖維化區(qū)及對(duì)照組6 個(gè)不同區(qū)域的心肌β-catenin 蛋白表達(dá)，使用ImageJ 軟件測(cè)量β-catenin 蛋白區(qū)域的平均光密度(average optical density， AOD)＝積分光密度值(integrated density，IOD)/陽(yáng)性面積(Area)代表該區(qū)域下β-catenin 蛋白表達(dá)強(qiáng)度，取AOD 的平均值代表該例標(biāo)本不同區(qū)域的β-catenin 蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

(3)用Masson 染色顯示心肌纖維化的程度:將DCM 組及對(duì)照組石蠟標(biāo)本的石蠟切片，

用Weigert 蘇木素染5 ～10 min，麗春紅酸性品紅溶液染5～10 min，磷鉬酸溶液處理約5 min，苯胺藍(lán)染液復(fù)染3 min，1%冰醋酸水溶液沖洗，脫水、透明、封片；用3DHISTECH 切片掃描儀掃描后觀察兩組心肌纖維化情況；在掃描儀CaseViewer 軟件內(nèi)截取200×放大倍數(shù)下隨機(jī)選取Masson 染色切片內(nèi)實(shí)驗(yàn)組纖維化區(qū)、非纖維化區(qū)及對(duì)照組各20 個(gè)心肌區(qū)域(除去心內(nèi)膜、心外膜區(qū))，用ImageJ 軟件測(cè)量纖維化區(qū)域面積S1/心肌區(qū)域面積S2 的比值代表該區(qū)域的纖維化程度，取比值的中位數(shù)代表該例心肌標(biāo)本的纖維化程度[3]。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用單因素方差分析分析，兩兩比較采用LSD 法；用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)比較DCM 組纖維化區(qū)與非纖維化區(qū)兩組間βcatenin 蛋白表達(dá)及纖維化程度差異；用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組β-catenin 蛋白表達(dá)及纖維化程度的兩兩差異；β-catenin 及心肌纖維化程度的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為0.8～1.0 極強(qiáng)相關(guān)，0.6～0.8 強(qiáng)相關(guān)，0.4 ～0.6 中等程度相關(guān)，0.2～0.4 弱相關(guān)，零～0.2 極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩種心肌的病理形態(tài)學(xué)分析及β-catenin 蛋白免疫組化染色分析 HE 染色及Masson 染色的組織病理形態(tài)見DCM 組心肌細(xì)胞對(duì)比正常組心肌細(xì)胞表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、外形伸長(zhǎng)，核增大，核深染，核膜出現(xiàn)溝裂、迂曲或皺褶，心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化，纖維化區(qū)心肌細(xì)胞可見空泡及玻璃樣變性伴心肌細(xì)胞萎縮，活動(dòng)期纖維化區(qū)成纖維細(xì)胞及間質(zhì)小血管增生，可見散在個(gè)別慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；靜止期纖維化區(qū)成纖維細(xì)胞減少，被大量纖維替代，周圍可見萎縮的心肌(圖1～2)；其中1 例纖維化區(qū)域周圍伴大量淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。DCM 心肌纖維化病例的纖維化區(qū)分布不均勻，部分以近心外膜和心內(nèi)膜處較密集，部分發(fā)生于心壁內(nèi)的纖維化主要沿間質(zhì)血管分布，并以血管為中心向周圍穿插排列(圖4～5)。

圖1 DCM 心肌細(xì)胞肥大，核增大，纖維化由血管周圍開始向鄰近心肌細(xì)胞間伸展，活動(dòng)期纖維化周圍心肌變性、萎縮，成纖維細(xì)胞增生(綠色箭頭)，散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭)(HE 染色)；圖2 對(duì)照組正常心肌細(xì)胞及血管周圍無(wú)明顯纖維化(HE染色)；圖3 DCM 纖維化區(qū)域內(nèi)可見較多慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(HE 染色)；圖4 DCM 心內(nèi)膜、心外膜及血管周纖維化(Masson 染色)；圖5 正常組心肌間質(zhì)無(wú)大片纖維化(Masson 染色)；圖6 活動(dòng)期纖維化區(qū)成纖維細(xì)胞表達(dá)β-catenin 蛋白(綠色箭頭)，周圍退變心肌內(nèi)β-catenin 蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌漫表達(dá)(紅色箭頭)(IHC 染色)；圖7 靜止期纖維化區(qū)成纖維細(xì)胞內(nèi)β-catenin 蛋白表達(dá)減少或不表達(dá)(紅色箭頭)，周圍心肌胞質(zhì)內(nèi)β-catenin 蛋白表達(dá)減少，局灶可出現(xiàn)蛋白聚集(綠色箭頭)(IHC 染色)；圖8 非纖維化區(qū)域心肌閏盤β-catenin 可表達(dá)升高，胞質(zhì)內(nèi)蛋白顆粒狀表達(dá)(紅色箭頭)(IHC 染色)；圖9 對(duì)照組正常心肌內(nèi)僅有部分β-catenin 蛋白在閏盤弱表達(dá)(IHC 染色)

β-catenin 在心臟中表達(dá)于心肌細(xì)胞閏盤、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞。 β-catenin 在DCM 中間質(zhì)纖維不表達(dá)，纖維化周圍區(qū)心肌細(xì)胞閏盤β-catenin表達(dá)升高，呈不規(guī)則塊狀染色，DCM 組13 例纖維化較重區(qū)域的周圍心肌內(nèi)β-catenin 蛋白有較密集表達(dá)；在活動(dòng)期纖維化區(qū)，可見成纖維細(xì)胞表達(dá)βcatenin 蛋白，周圍退變心肌內(nèi)β-catenin 蛋白在心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌漫表達(dá)(圖6)；靜止期纖維化區(qū)成纖維細(xì)胞內(nèi)β-catenin 蛋白表達(dá)減少或不表達(dá)，周圍心肌胞質(zhì)內(nèi)蛋白表達(dá)減少(圖7)；非纖維化區(qū)域心肌閏盤β-catenin 可表達(dá)升高，呈粗線狀染色，部分也可呈塊狀但不常見(圖8)。 在DCM 組中，β-catenin 除在閏盤處表達(dá)外，在細(xì)胞質(zhì)中也可出現(xiàn)顆粒狀表達(dá)、染色加深并沿肌絲分布于心肌細(xì)胞核兩側(cè)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；而正常組內(nèi)心肌細(xì)胞閏盤β-catenin 蛋白呈線狀染色，僅5 例出現(xiàn)β-catenin 蛋白集聚，而細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)未出現(xiàn)蛋白顆粒(圖9)。

2.免疫組織化學(xué)法及特殊染色法檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)情況及心肌纖維化情況

(1) DCM 組纖維化區(qū)、非纖維化區(qū)與對(duì)照組βcatenin 蛋白表達(dá)的AOD 比較DCM 組纖維化區(qū)、非纖維化區(qū)與對(duì)照組β-catenin 蛋白表達(dá)的AOD 總體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＝0.01)； DCM 組纖維化區(qū)與對(duì)照組心肌β-catenin 蛋白表達(dá)AOD 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t ＝3.047，P ＝0.009)，DCM 組非纖維化區(qū)與對(duì)照組心肌β-catenin 蛋白AOD 表達(dá)也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t ＝2.626，P ＝0.014)，DCM 組纖維化區(qū)與非纖維化區(qū)蛋白表達(dá)AOD 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝1.372，P ＝0.192， 表1)。

圖10 A:組心肌纖維化區(qū)β-catenin 與心肌纖維化程度的相關(guān)性；B:DCM 組心肌非纖維化區(qū)β-catenin 與心肌纖維化程度的相關(guān)性；C:對(duì)照組β-catenin 與心肌纖維化程度的相關(guān)性

表1 三組β-catenin 及纖維化程度S1/S2 比較ˉ

表1 三組β-catenin 及纖維化程度S1/S2 比較ˉ

組別 β-catenin AOD S1/S2 DCM 組纖維化區(qū)(n＝15) 0.59±0.13 0.57±0.07 DCM 組非纖維化區(qū)(n ＝15) 0.56±0.11 0.26±0.08對(duì)照組(n ＝15) 0.47±0.09 0.30±0.05 F 值 5.17 91.33 P 值 0.01 ＜0.001

3.DCM 組纖維化區(qū)組織、非纖維化區(qū)與對(duì)照組纖維化區(qū)域面積S1/心肌區(qū)域面積S2 比值的比較

DCM 組纖維化區(qū)、非纖維化區(qū)與對(duì)照組S1/S2 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)； DCM 組纖維化區(qū)與非纖維化區(qū)S1/S2 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t ＝10.124，P＜0.001)；DCM 組纖維化區(qū)與對(duì)照組S1/S2 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t ＝12.051，P＜0.001)；但DCM 組非纖維化區(qū)與對(duì)照組S1/S2 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝-1.455，P ＝0.157，表1)。

4.β-catenin 蛋白在DCM 組與對(duì)照組心肌中與心肌纖維化的相關(guān)性分析 DCM 組纖維化區(qū)βcatenin 蛋白AOD 與心肌纖維化區(qū)纖維化程度(S1/S2)呈明顯正相關(guān)(r ＝0.681，P ＝0.005)；DCM 組非纖維化區(qū)β-catenin 蛋白AOD 與心肌非纖維化區(qū)纖維化 程 度(S1/S2) 無(wú) 相 關(guān) 性(r ＝- 0.501，P ＝0.057)；對(duì)照組纖維化區(qū)β-catenin 蛋白AOD 與心肌纖維化程度(S1/S2)無(wú)相關(guān)性(r ＝-0.023，P ＝0.935，圖10)。

討 論

心肌間質(zhì)纖維化是DCM 心肌的主要特征之一，心肌細(xì)胞間及血管周圍纖維化，是DCM 的典型病理表現(xiàn)[4]。 本研究表明，DCM 非纖維化區(qū)與對(duì)照組的β-catenin 蛋白表達(dá)并無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明DCM心肌纖維化主要圍繞血管呈局灶及片狀，而非整體心肌細(xì)胞間質(zhì)均發(fā)生廣泛纖維化。 纖維化區(qū)周圍心肌可見心肌細(xì)胞變性、萎縮，纖維化區(qū)周圍可見散在的慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可能與下面將要討論的βcatenin 的作用相關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)中DCM 纖維化需與限制性心肌病纖維化相鑒別，具有嗜酸細(xì)胞增多癥的限制性心肌病可出現(xiàn)心內(nèi)膜心肌纖維化、L?ffer 心肌炎，而無(wú)嗜酸細(xì)胞增多癥的限制性心肌病可出現(xiàn)灶片狀或彌漫的纖維化，但心內(nèi)膜無(wú)纖維化改變。

β-catenin 蛋白作為Wnt /β-catenin 信號(hào)通路的重要組成部分，在體內(nèi)各器官的纖維化病變中均具有重要作用。 劉金娟等[5]發(fā)現(xiàn)， 硬皮病小鼠皮膚組織中β-Catenin 蛋白增加，認(rèn)為Wnt/β-Catenin 通路影響皮膚的纖維化病變。 He 等[6]發(fā)現(xiàn)， 慢性腎損傷中Wnt /β-catenin 通路激活將導(dǎo)致β-catenin 累積并誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá)。 反映了Wnt /β-catenin信號(hào)通路過(guò)度激活會(huì)促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。 Ge 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化程度與β-catenin 表達(dá)水平呈正相關(guān)，沉默β-catenin 蛋白可抑制膠原分泌和肝星狀細(xì)胞增殖，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 而在心臟的心肌纖維化中，β-catenin 及其所在的Wnt/β-catenin 通路亦起著重要的作用，心外膜細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞也有Wnt 反應(yīng)，Wnt1 在體外誘導(dǎo)β-catenin 依賴性心外膜上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖[8]。

在各種心臟的纖維化病變中，β-catenin 蛋白通常表達(dá)升高并認(rèn)為與心肌纖維化關(guān)系密切。 Roberts等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與β-catenin 增多相關(guān)的AnkB 功能喪失的小鼠模型在10 周齡時(shí)出現(xiàn)顯著的結(jié)構(gòu)異常，包括顯著的雙心室擴(kuò)張，纖維化和射血分?jǐn)?shù)減少。Lin 等[10]在心肌梗塞(MI)患者的心肌及相關(guān)動(dòng)物模型中檢測(cè)到β-catenin 蛋白在瘢痕區(qū)間質(zhì)內(nèi)表達(dá)升高并濃縮。 在我們的實(shí)驗(yàn)中，β-catenin 的表達(dá)于成纖維細(xì)胞內(nèi)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌的閏盤或附近；纖維化活動(dòng)期成纖維細(xì)胞β-catenin 表達(dá)明顯稍強(qiáng)于纖維化靜止期，周圍退變心肌內(nèi)β-catenin 蛋白在心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌漫表達(dá)，DCM 心肌細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白普遍較正常組高，纖維化區(qū)與非纖維化區(qū)并無(wú)差異，表明DCM 的心肌纖維化與心肌梗塞(MI)成因不同，我們推測(cè)DCM 的病因多樣，為廣泛的非直接損傷，如遺傳、免疫、病毒感染等，不同于MI 由于缺血而導(dǎo)致的局部心肌損傷所致。

研究表明β-catenin 是細(xì)胞表面鈣粘蛋白蛋白復(fù)合物的亞基，可被多種致病因素激活。 Wnt /βcatenin 的持續(xù)活化與纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Yu 等[11]研究表明，在許多由上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的纖維增生性疾病中，有β-catenin 核異位表達(dá)，Lin等[10]的動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞豬巨細(xì)胞病毒(pCMV)-β-catenin 蛋白質(zhì)粒過(guò)表達(dá)βcatenin 蛋白，轉(zhuǎn)錄因子在患有心源性高血壓的Wistar 大鼠中顯示核定位，轉(zhuǎn)染β-catenin 蛋白質(zhì)粒以劑量依賴性方式誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并降低存活途徑標(biāo)志物的表達(dá)。 Haybar 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性心肌中，心臟損傷后Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)至心外膜，使得Wnt1 表達(dá)增加，成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞擴(kuò)增，導(dǎo)致心肌纖維化，Wnt5a 在心肌梗塞后誘導(dǎo)IL-6 并引起成纖維細(xì)胞和炎癥的相互作用。 我們也觀察到，DCM 患者纖維化區(qū)域內(nèi)可以出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥性反應(yīng)，但僅為個(gè)例，并非普遍，Kawai 等[13]研究證實(shí)，在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)小鼠心肌炎可發(fā)生擴(kuò)張型心肌病。 我們觀察到β-catenin 在DCM 心肌細(xì)胞內(nèi)普遍升高，而不在心肌間質(zhì)纖維化區(qū)，其原因是否與纖維化的成因等不同有關(guān)? 纖維化與纖維疤痕的病理有差別? 還有待研究及探討。

在我們的研究中，觀察到的β-catenin 蛋白在心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)及閏盤處聚集是很有趣的現(xiàn)象之一，通過(guò)結(jié)合形態(tài)學(xué)比對(duì)觀察，纖維化區(qū)的一部分蛋白聚集表達(dá)可能和閏盤的變異相關(guān)，即β-catenin 蛋白表達(dá)隨閏盤的變異增多，范圍增寬；而在活動(dòng)期纖維化區(qū)DCM 退變心肌胞漿中β-catenin 蛋白的顆粒狀表達(dá)及聚集則可能是纖維化的潛在基礎(chǔ)條件，目前研究[14-15]認(rèn)為，一旦Wnt /β-catenin 通路被激活，β-catenin 就會(huì)穩(wěn)定表達(dá)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在那里與T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子結(jié)合，刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括纖維化相關(guān)的基因表達(dá)。 βcatenin 在細(xì)胞質(zhì)中積累并引起Wnt 靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，缺乏Wnt 配體，β-catenin 被泛素化并被靶向蛋白酶體降解，Wnt 信號(hào)被抑制，而在沒(méi)有Wnt 刺激的情況下，細(xì)胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白水平通過(guò)降解復(fù)合物保持低水平，而我們觀察到活動(dòng)期纖維化區(qū)散在的慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間接印證了相關(guān)研究。 因此βcatenin 的表達(dá)部位的變化及凝集可能象征著相關(guān)纖維化基因的表達(dá)，而其通過(guò)何種方式轉(zhuǎn)移、纖維化與成纖維細(xì)胞、閏盤的關(guān)系也有待于進(jìn)一步探索。

綜上所述，本材料表明β-catenin 蛋白表達(dá)主要在心臟的閏盤及近旁、成纖維細(xì)胞，其含量增多與DCM 患者心肌纖維化程度呈正相關(guān)，在β-catenin 蛋白增加的基礎(chǔ)上，β-catenin 蛋白的部位變化、炎癥刺激等因素可能是DCM 患者心肌纖維化的主要因素。本研究印證了部分相關(guān)動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，并揭示了β-catenin 蛋白于DCM 與其他心臟病變中的類似及不同之處，探究了β-catenin 與心肌纖維化的關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步的原因及相關(guān)分子通路機(jī)制還待進(jìn)一步探索。