鴨源致病性大腸桿菌的分離鑒定及辣木葉水提物抑菌效果分析

董雯雯 張世棟 王春玲 艾洪新 李峰

摘 要：大腸桿菌病是嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的一類細菌性疾病，臨床上多使用抗生素治療，但耐藥菌株的增多使抗生素的治療效果大大下降，同時帶來食品安全隱患。因此，篩選安全、天然抑菌藥物成為研究熱點。本試驗從疑患大腸桿菌病死鴨無菌采集病料，分離出1株細菌，并對分離的細菌進行形態(tài)特征、生化試驗、藥敏試驗、16SrDNA遺傳分析，最終判定該分離菌為大腸桿菌。隨后，選用本實驗室提取的辣木葉水提物（MLHE）進行體外試驗驗證抑菌活性，利用微量肉湯稀釋法檢測MLHE最小抑菌濃度（MIC）、分光光度計測定OD630細菌生長曲線以及半固體培養(yǎng)基測定MLHE對分離大腸桿菌叢動能力的影響。結(jié)果表明，0.25 g/mL的MLHE可顯著抑制大腸桿菌的增殖及叢動能力。該研究結(jié)果為指導鴨大腸桿菌臨床用藥及防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鴨源大腸桿菌;分離鑒定;辣木葉水提物;叢動

禽大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌引起禽類的一種以局部或全身性癥狀為特征的常見人畜共患細菌性疾病，各個日齡的禽類均可被感染，其血清型可能高達數(shù)千種[1]。該病常與其他病毒病（流感、新城疫、傳染性支氣管炎）及支原體病混合感染，增加患病禽的死亡率[2]。大腸桿菌的致病性通常與其所攜帶的毒力基因協(xié)同作用密切相關(guān)[3]，致病菌侵入機體后，首先通過表達的多種黏附素定植于機體上皮細胞，繼而釋放各種毒素，造成各組織器官的炎癥反應(yīng)，嚴重時造成全身性敗血癥甚至死亡。致病菌進入宿主體內(nèi)后，通過調(diào)控相關(guān)毒力基因的表達及相互作用而快速的適應(yīng)宿主環(huán)境，順利逃避宿主的防御系統(tǒng)，誘發(fā)宿主疾病甚至死亡。

目前，抗生素被廣泛應(yīng)用于動物性細菌性疾病的治療，長期不合理使用抗生素致使大腸桿菌的耐藥性不斷擴大，給該病的防治帶來巨大困難，嚴重影響我國養(yǎng)禽業(yè)的健康高效發(fā)展。中藥具有低殘留、抗炎、抗菌、抗損傷等作用，屬于天然藥物，在動物體內(nèi)具有靶點多、作用范圍廣以及能加強機體免疫功能、改善內(nèi)分泌系統(tǒng)、調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)的作用。因此，中藥在禽源性大腸桿菌病的治療上是一個較好的選擇。辣木（Moringa oleifera Lam.）屬被子門辣木科辣木屬植物，其提取物具有高鈣、高蛋白質(zhì)、高纖維和低脂質(zhì)的優(yōu)點，且兼具降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等功效，因此，近年來辣木作為一種“藥食兩用”天然植物備受關(guān)注[4]。我國在2012年特批辣木為新資源食品[5]。

本試驗病料來自山東某養(yǎng)鴨場，該養(yǎng)鴨場發(fā)病鴨群主要表現(xiàn)為精神不振、采食量下降、呼吸困難、腹瀉，部分雛鴨出現(xiàn)死亡。對分離得到的病原菌進行分離鑒定及生物學特性分析，最終確定引起鴨場雛鴨死亡的主要病原菌為大腸桿菌，而且本試驗進一步分析病原菌的耐藥性及毒力基因，并選用本實驗室前期提取的辣木葉水提物（MLHE）進行體外試驗驗證抑菌活性，旨在找出針對大腸桿菌抑菌效果良好的藥物，為養(yǎng)鴨場大腸桿菌病的診斷和高效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

送檢疑患大腸桿菌病料來自山東地區(qū)某養(yǎng)鴨場，經(jīng)過無菌操作采集病死鴨腦、心、肝等器官備用。

1.2 主要試劑

革蘭氏染色液，購自北京索萊寶科技有限公司;抗菌藥物藥敏試紙，購自北京艾博利德商貿(mào)有限公司;微量生化發(fā)酵管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司;培養(yǎng)基及其他試劑，購自生工生物（上海）股份有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、DNA膠回收試劑盒，購自Axygen公司;SPF鴨胚，購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司;辣木葉，購自西安金萃坊植物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)與病毒檢驗

無菌采集病死鴨的腦、肝、心等組織器官，用接種環(huán)無菌蘸取病變部位，接種于麥康凱瓊脂平板和LB瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，觀察記錄細菌生長狀況及形態(tài)。隨后，從平板上用接種環(huán)挑取狀態(tài)良好的單菌落，進行革蘭氏染色，并在光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)及染色特性。

為驗證是否有病毒感染的可能性，同時研磨病變組織制備懸液，反復(fù)凍融3次后接種于9日齡SPF鴨胚，144 h后觀察是否有病毒感染，若傳1代鴨胚無病變，則收獲96 h鴨胚尿囊液繼續(xù)傳代2次，并觀察病變。

1.4 細菌藥敏及生化試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會推薦的標準Kirby-Bauer（K-B）紙片法進行試驗操作及結(jié)果判斷[6]。對優(yōu)勢菌進行純培養(yǎng)，參照伯杰氏手冊，使用細菌微量生化管，按照說明書進行生化鑒定及結(jié)果判定[7]。

1.5 16S rDNA基因測定及進化樹分析

挑取單個細菌菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h。用細菌基因組DNA提取試劑盒進行細菌基因組DNA的提取，產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。設(shè)計細菌通用16S rRNA引物，F(xiàn)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’;R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT -3’，并由上海生工生物工程有限公司合成。利用細菌基因組DNA為模板，按照以下比例配制PCR反應(yīng)體系：模板 1 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 10μL，補充ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行膠回收后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.6 毒力基因檢測

參照文獻[8]合成大腸桿菌血清抗性蛋白（Iss）、溶血素F（HlyF）、溫度敏感血凝素基因（Tsh）、毒素基因（Ast A）、鐵離子攝取系統(tǒng)基因（IroN、IucD）引物，引物具體信息見表1。以提取的大腸桿菌DNA為模板進行PCR擴增，檢測其攜帶的毒力基因，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠成像系統(tǒng)進行觀察并記錄結(jié)果。

1.7 致病性試驗

將分離純化的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h。取培養(yǎng)液（菌量1×106 CFU/mL）0.5 mL肌肉注射于5只6日齡雛鴨，對照組注射0.5 mL生理鹽水，觀察癥狀，并無菌采集病死鴨心、肝、脾進行病原微生物分離和鑒定。

1.8 最小抑菌濃度（minimal inhibition concentration， MIC）測定

采用微量肉湯稀釋法測定辣木葉水提物（MLHE）對菌株的MIC值。調(diào)整過夜培養(yǎng)的細菌含量至1×106 CFU/mL，將實驗室前期提取的MLHE稀釋至所需濃度，取0.1 mL至96孔板的第一孔，按2倍倍比稀釋法稀釋至第7孔，每孔加100 μL藥樣和100 μL菌液，第8孔加入100 μ

L LB培養(yǎng)液和100 μL菌液設(shè)為陽性對照，第9孔添加200 μL LB培養(yǎng)液設(shè)為陰性對照。置37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，以肉眼觀察到能抑制80%細菌生長的最低藥物濃度作為MIC。

1.9 MLHE對細菌生長曲線的影響

調(diào)整菌液濃度至1×106 CFU/mL，分別接種至等量的滅菌LB肉湯、含1/2 MIC濃度和MIC濃度MLHE的LB肉湯中，使最終細菌數(shù)量達到1×104 CFU/mL，設(shè)為對應(yīng)的臨床分離株組、1/2 MIC組和MIC組，每組設(shè)三個平行，放置37 ℃、180 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)，每組每隔2 h吸取等量菌液測定OD630，共培養(yǎng)24 h。以時間為橫坐標，菌懸液吸光值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.10 MLHE對細菌叢動的影響

在添加不同濃度MLHE的叢動培養(yǎng)基（0.5%LB瓊脂培養(yǎng)基）上，于中心滴加2 μL的過夜培養(yǎng)菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果并測量從接種點向周圍擴散生長范圍的直徑。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離及形態(tài)觀察

從病死鴨各臟器分離得到的細菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)板上劃線培養(yǎng)18 h，可見微紅色、菌落中心呈深桃紅色、圓形、扁平且邊緣整齊、表面光滑的濕潤菌落，直徑約3 mm左右，呈現(xiàn)典型的大腸桿菌菌落特性（圖1）。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后，發(fā)現(xiàn)菌體為細長、兩短鈍圓的長桿狀革蘭氏陰性菌，多呈單個存在（圖2）。此外，組織研磨液連續(xù)3代接種SPF鴨胚144 h后均無病變，由此排除病毒感染的可能。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

K-B紙片擴散法鑒定分離菌株藥敏性，結(jié)果如表2所示：分離的菌株對頭孢西叮、頭孢吡肟、氨曲南3種藥物高度敏感;對其他的7種藥物低敏感或不敏感。

2.3 生化試驗鑒定

分離株生化特性表現(xiàn)為：乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇均為陽性，明膠、蔗糖、H2S、枸櫞酸鹽試驗為陰性，基本符合大腸桿菌屬特性。生化試驗結(jié)果見表3。

2.4 16S rDNA基因測序及進化樹分析

提取菌株基因組DNA，PCR擴增其16S rDNA序列。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增出的目的基因條帶大小約1 492 bp，與預(yù)期大小相符（圖 3）。利用MegAlign軟件對分離菌株的核苷酸序列與從NCBI中下載的相近菌株進行同源性分析，結(jié)果顯示，本試驗分離出的菌株與GenBank中收錄的大腸桿菌16S rDNA序列同源性達99%以上;系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，該分離株與中國TYN株、韓國PYK20株及日本S18株位于同一個分支上，屬于統(tǒng)一亞群，與中國TYN株的進化關(guān)系最近（圖4）。綜合上述試驗分析結(jié)果，可以確定該分離株為大腸桿菌。

2.5 毒力基因PCR檢測結(jié)果

用設(shè)計合成的6種大腸桿菌毒力基因的特異性引物進行PCR鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果顯示，該分離株攜帶Iss（309 bp）、HlyF（622 bp）、Tsh（488 bp）、Ast A（116 bp）、IroN（667 bp）、IucD（714 bp）6種毒力基因，結(jié)果見圖5。其中Ast A基因檢測結(jié)果顯示較弱，提示可能該毒力基因含量低。

2.6 致病性試驗

將新鮮純化后的分離株感染5日齡雛鴨12 h后，感染鴨只陸續(xù)出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁、扎堆怕冷、采食量下降癥狀。24 h后出現(xiàn)死亡病例，對病死鴨只進行剖檢發(fā)現(xiàn)：病死鴨腸道有出血，有粘性滲出，糞便稀薄，呈青綠色或灰白色，肛門周圍污穢;心包有積液，心包膜混濁;肝臟腫大?？瞻讓φ战M雛鴨均健康存活。采取死亡鴨病變組織器官，分離出的病原菌經(jīng)實驗室鑒定同接種菌一致，顯示該分離菌具有很強的致病性。

2.7 MIC測定

由表4可知，大腸桿菌分別在15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000 mg/mL MLHE作用24 h后，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中細菌數(shù)量隨MLHE濃度的增加而減少，說明MLHE可抑制大腸桿菌的生長，且抑制效果與藥物濃度呈正相關(guān)。當MLHE濃度為250 mg/mL（即0.25 g/mL）時，可抑制約80%大腸桿菌臨床分離株的生長，由此可判斷MLHE對大腸桿菌臨床分離株的MIC為0.25 g/mL。

2.8 MLHE對大腸桿菌生長曲線影響

由圖6可知，細菌整體的生長曲線大致呈“S”型，具有明顯的生長對數(shù)期和穩(wěn)定生長期，符合大腸桿菌的生長規(guī)律。此外，MLHE在0.25～0.5 g/mL濃度時大腸桿菌的增殖較為緩慢，表現(xiàn)出明顯的細菌抑制效果（P<0.05）;濃度為0.5 g/mL的MLHE組細菌抑制效果最佳。MLHE對大腸桿菌生長曲線的影響見圖6。

2.9 MLHE對大腸桿菌叢動能力的影響

在含有MLHE的叢動檢測培養(yǎng)基中，辣木葉濃度越高，大腸桿菌生長范圍越小，如圖7所示。無藥組擴散直徑為（14.9±0.25）mm，0.5 g/mL MLHE組和0.25 g/mL MLHE組細菌擴散直徑分別為（7.86±0.44）mm和（9.69±0.51）mm。

3 討論

近年來，大腸桿菌耐藥譜不斷增加給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，耐藥細菌借助基因水平轉(zhuǎn)移等方式在人、動物、環(huán)境循環(huán)傳播，增加了人類攝入耐藥基因的風險，給公共衛(wèi)生和食品安全造成了重大威脅。本研究從分離菌株藥敏試驗結(jié)果觀察到，大腸桿菌對第3代頭孢類藥物及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素高度敏感，對多粘菌素、糖肽類、氨基糖苷類等抗生素均具有耐藥性。多粘菌素通常被認為是治療青霉烯類大腸桿菌感染的最后一道防線[9]，其耐藥基因可經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，本研究發(fā)現(xiàn)該大腸桿菌對多粘菌素呈現(xiàn)一定的耐藥性，與朱琳清[10]的研究結(jié)果相一致，因此應(yīng)該重視相關(guān)方面的調(diào)查，以控制耐藥趨勢的擴散。從藥敏結(jié)果推測，該養(yǎng)殖場可能存在抗生素藥物使用不規(guī)范的情況，導致大腸桿菌的多重耐藥，因此要加強養(yǎng)殖場的精細化管理[11]，同時可增加中獸藥等無抗、減抗藥物的臨床應(yīng)用和推廣，以減少更多耐藥菌株的出現(xiàn)。

大腸桿菌的致病性通常由多種毒力因子如黏附素、攝鐵系統(tǒng)、毒素、脂多糖、侵襲素和血清抗性相關(guān)因子等相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[12]，調(diào)控自身毒力基因的表達在感染宿主中起著非常重要的作用。首先，細菌經(jīng)過黏附素的作用率先定殖于宿主細胞，開啟感染宿主的第一步，為了適應(yīng)宿主環(huán)境，菌體內(nèi)的一些毒力因子開始特異性表達[13]，如：攝鐵系統(tǒng)相關(guān)基因的表達可顯著增強細菌的生存能力及致病力;血清抗性蛋白基因的異常表達增強細菌的血清抗性，逃逸宿主免疫反應(yīng)。王俊麗[14]對聊城地區(qū)收集的212株禽源大腸桿菌進行毒力基因的檢測，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)Tsh毒力基因的檢出率高達76.5%。郭長明[15]對分離的21株鴨源大腸桿菌毒株毒力基因進行分析，發(fā)現(xiàn)同時含5種毒力基因的菌株占28.57%，含4種毒力基因的占23.81%。王怡平[16]研究推測，能檢出Iss、CvaC、Irp2、IucD、IroN、Tsh 6種毒力基因中的3種及以上就可判定為該菌為致病性大腸桿菌。本研究對分離得到的大腸桿菌進行毒力基因檢測，可同時檢測出大腸桿菌抗血清存活因子相關(guān)基因、溶血素基因、黏附相關(guān)基因、溫度敏感血凝素相關(guān)基因、毒素基因、鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因這6種毒力基因，致病性試驗結(jié)果顯示與王怡平的推測結(jié)果一致。本試驗結(jié)果表明，分離的鴨源大腸桿菌具有較強致病性。

辣木的抑菌活性已經(jīng)獲得了廣泛的認可。使用不同提取溶劑提取的辣木葉有效成分不同，抑菌能力也有差別。由于成本低、容易獲取、溶解能力強且相對安全，目前廣泛應(yīng)用于提取的溶劑主要是水和乙醇。目前的研究表明，辣木的各個部位提取物對致病菌具有非常強的抑制作用。Moyo B等[17]研究發(fā)現(xiàn)辣木葉的丙酮提取物中的活性成分對大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌和克氏微球菌都表現(xiàn)出了非常強的抗菌能力。魏宇清[18]研究了辣木葉和辣木莖對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)辣木莖的醇提物的抑菌能力強于水提物，辣木葉水提物的抑菌能力強于醇提物。研究[19]發(fā)現(xiàn)，辣木葉提取物的抗菌活性與含有的單寧、黃酮類化合物、酚類化合物有關(guān)，且辣木葉中含有的辣木素可分解成兩個異硫氰酸芐酯分子，也被證明有抗菌活性。本研究得到的結(jié)果與上述研究結(jié)果具有一致性，盡管使用了不同的提取溶劑，但辣木葉提取物都表現(xiàn)出比較好的抑菌能力，說明辣木的有效抗菌物質(zhì)溶解性非常好，既可以溶解于水等無機溶劑，又可以溶解于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。

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