菌根真菌和根瘤菌接種對紫花苜蓿和無芒雀麥混播牧草生物量的影響

謝開云，孫伶俐，張力文，鄭萬菊，萬江春，趙 云

(1. 西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室，新疆農業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 阜康市草原站，新疆 阜康 831500； 3. 中國牧工商集團有限公司，北京 100070)

豆科/禾本科(簡稱豆/禾)牧草混播草地以其較高的生產力、較好的營養(yǎng)搭配和經濟有效的氮素來源在畜牧業(yè)發(fā)展中占據(jù)重要的地位。建植高效優(yōu)質的豆科/禾本科牧草混播草地，對于解決當前畜牧業(yè)轉型發(fā)展中飼料糧短缺問題及實現(xiàn)農牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)和根瘤菌是自然界存在的兩類重要的共生微生物，分別能夠與宿主植物形成叢枝菌根和根瘤。AMF和根瘤菌既能單獨生存于宿主植物根部，也能共同協(xié)作形成二菌一宿主的三重共生體系[1]。兩類菌株能促進植株在貧瘠土地中對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收，改善宿主植物的生長狀況[2-5]。目前國內外關于菌根真菌和根瘤菌雙接種的研究主要集中單作作物(如大豆(GlycinemaxL)[6-7]和蠶豆(ViciafabaL)[8-9])、間作作物(如玉米(ZeamaysL)/大豆[10]和玉米/蠶豆[11])、多年生牧草(如紫花苜蓿(MedicagosativaL)[12-14])，而對豆禾混播草地的研究鮮有報道。在混播草地中，對于禾本科牧草而言，可以形成菌根真菌-禾本科牧草兩重共生體，對豆科牧草而言，可以形成菌根真菌-豆科植物-根瘤菌三重共生體[15]，然而微生物介導的共生體在牧草生長中的所起的作用及貢獻仍不清楚。因此，本研究以單播與混播的紫花苜蓿和無芒雀麥為研究對象，通過研究叢枝菌根真菌和根瘤菌接種對混播中紫花苜蓿和無芒雀麥牧草生長的影響，以期為混播草地的建植和制定科學的管理措施提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紫花苜蓿(Medicagosativa，‘新苜4號’品種，新疆農業(yè)大學牧草遺傳育種實驗室提供)和無芒雀麥(BromusinermisLeyss，‘烏蘇1號’品種，烏蘇市草原站提供)。試驗用盆內口徑為22.5 cm，底徑為20.5 cm，高為28 cm的加厚樹脂塑料盆，每盆裝風干土25 kg。供試土壤為粘土，取自新疆農業(yè)大學三坪農業(yè)綜合試驗站試驗地0～30 cm表層土，土壤田間持水量為26%，容重為1.32 g·cm-3。供試土壤理化性質為：土壤有機質含量為1.68 g·kg-1，pH值為7.6，全氮含量為1.16 g·kg-1，堿解氮含量為26.57 mg·kg-1，全磷含量為0.64 g·kg-1，速效磷含量為5.92 mg·kg-1，全鉀含量為16.31 g·kg-1，速效鉀含量為154.34 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗采用雙因素完全隨機區(qū)組設計，設置T處理為4個滅菌土壤接菌，即不接種菌(CK)，接種根瘤菌(R)，接種菌根真菌(F)，根瘤菌和菌根真菌雙接種(FR)；M處理為3個種植方式，即紫花苜蓿單播(A)，無芒雀麥單播(S)，紫花苜蓿和無芒雀麥1∶1混播(AS)。共12個處理，每個處理重復3次，試驗共計36盆。

試驗于2019年4月25日將紫花苜蓿和無芒雀麥用育苗盤在培養(yǎng)箱內育苗培養(yǎng)一周。選擇大小和表型一致的強壯苗，分3種模式(無芒雀麥單播、紫花苜蓿單播、無芒雀麥和紫花苜?；觳?移栽到塑料桶里。每盆定苗4株，單播時等距分布，混播時保持1∶1比例對角等距分布。利用土壤含水量測定儀(WET Sensor HH2)監(jiān)測土壤表層8 cm的體積含水量，均值低于15%時，對所有處理澆2 000 mL自來水。手工防除雜草，每盆掛粘蟲板來防除蟲害。

1.3 測定指標與方法

地上和地下生物量的測定：于2019年10月對所有盆進行刈割(混播處理分種刈割)，并稱其鮮重(g)，隨后取其根系，用自來水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，稱其鮮重。地上和地下部分裝紙袋放置烘箱在105℃下殺青0.5 h，在65℃烘48 h至恒重，稱其干重(g)。

分蘗數(shù)(分枝數(shù))測定：在取樣前，對紫花苜蓿和無芒雀麥分枝/蘗數(shù)進行統(tǒng)計。單播時將每盆內4株無芒雀麥的分蘗數(shù)(紫花苜蓿的分枝數(shù))平均值作為一個測定值，混播時將2株無芒雀麥(2株紫花苜蓿)的均值作為一個測定值。

相對葉綠素含量(Soil and plant analyzer develotrnent，SPAD)：用SPAD-502葉綠素計在取樣前測量紫花苜蓿和無芒雀麥葉片的SPAD值，被測紫花苜蓿葉片選最上部的完全展開葉，無芒雀麥選取最上部的完全展開葉(第3片葉)。每種植物測定5片葉，求其平均值。

株高測定：在取樣前，測定每盆內無芒雀麥和紫花苜蓿的株高，單播時將每盆內4株平均值作為一個測定值，混播時將2株的均值作為一個測定值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)整理和匯總，用Graph Pad Prism 7.0軟件進行制圖，SAS 9.0軟件統(tǒng)計分析。用PROC GLM程序對單播和混播種植的紫花苜蓿和無芒雀麥的干物質生物量、株高、分枝/蘗數(shù)和SPAD進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同接種處理對混播系統(tǒng)牧草株高的影響

對不同接種處理下單播和混播的紫花苜蓿和無芒雀麥地上和地下單株干物質生物量、株高、分枝/蘗數(shù)和SPAD值進行GLM方差分析(表1)，結果表明：不同接種處理對紫花苜蓿和無芒雀麥地上和地下單株干物質生物量具有顯著影響(P<0.001)，紫花苜蓿和無芒雀麥地上和地下干物質生物量在單播和混播兩種種植方式間也具有極顯著差異(P<0.001)。接種處理和混播方式之間的交互效應對紫花苜蓿和無芒雀麥地上干物質生物量、株高、分枝/蘗數(shù)及SPAD值均無顯著影響。

表1 不同處理下紫花苜蓿和無芒雀麥生物量、株高、分枝/蘗數(shù)和SPAD值的方差分析Table 1 Analysis of variance of biomass,plant height,number of branches/tillers and SPAD values of alfalfa and smooth brome under different treatments

在單播和混播處理下，接種根瘤菌、菌根真菌以及根瘤菌和菌根真菌雙接種處理對紫花苜蓿和無芒雀麥的株高均無顯著影響(圖1A和1B)。另外，單播的紫花苜蓿株高顯著高于混播(|t|=4.860，P=0.0028)，而在混播中的無芒雀麥株高顯著高于單播(|t|=6.906，P=0.0005)。

2.2 不同接種處理對混播系統(tǒng)牧草對分枝/蘗的影響

對單播和混播中的紫花苜蓿和無芒雀麥的分枝數(shù)和分蘗數(shù)進行分析，結果表明：在單播和混播處理中，接種根瘤菌、菌根真菌以及根瘤菌和菌根真菌雙接種處理下紫花苜蓿的分枝數(shù)與對照均無顯著差異(圖2A)。接種根瘤菌、菌根真菌以及根瘤菌和菌根真菌雙接種處理對單播中無芒雀麥的分蘗數(shù)無顯著差異(圖2B)，而接種菌根真菌處理下混播中的無芒雀麥的分蘗數(shù)顯著高于對照(圖2B，P<0.05)。另外，單播的紫花苜蓿的分枝數(shù)顯著高于混播(|t|=4.134，P=0.0257)，而無芒雀麥的分蘗數(shù)在單播和混播處理下無顯著差異(|t|=1.853，P=0.1609)。

圖1 不同接種處理對單播和混播中的紫花苜蓿和無芒雀麥株高的影響Fig.1 Effects of different inoculation treatments on plant height of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing注：圖A代表單播和混播處理下的紫花苜蓿；圖B代表單播和混播處理下的無芒雀麥。不同的大寫字母表示單播不同接種處理下具有顯著差異(P<0.05)，不同小寫字母表示混播中不同接種處理下具有顯著差異(P<0.05)，下同；CK，R，F(xiàn)和FR分別表示試驗對照、接種根瘤菌、接種菌根真菌和根瘤菌和菌根真菌雙接種Note:Figure A represents alfalfa in pure and mixed sowing,and figure B represents smooth brome in pure and mixed sowing. Different capital letters indicated that there are significant differences in pure sowing under different inoculation treatments at the 0.05 level;different lowercase letters indicated that there are significant differences under different inoculation treatments in mixed sowing at the 0.05 level,the same as below. CK,R,F and FR represents control,Inoculated rhizobium,Inoculated mycorrhizal fungi and Inoculated rhizobium and mycorrhizal fungi,respectively

圖2 不同接種處理對單播和混播中的紫花苜蓿和無芒雀麥分枝/分蘗數(shù)的影響Fig.2 Effects of different inoculation treatments on the number of branches/tillers of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing

2.3 不同接種處理對混播系統(tǒng)牧草SPAD值的影響

對單播和混播中的紫花苜蓿和無芒雀麥的SPAD值進行分析，結果表明：單播紫花苜蓿的SPAD值在接種根瘤菌和雙接種處理下顯著高于對照和單獨接種菌根真菌處理(圖3A，P<0.05)，而在混播種植下紫花苜蓿的SPAD值在接種根瘤菌、菌根真菌及雙菌接種處理與對照物無顯著差異(圖3A)。單播的無芒雀麥的SPAD值在接種菌根真菌處理下顯著高于對照(圖3B，P<0.05)，而在混播種植下無芒雀麥的SPAD值在接種根瘤菌、菌根真菌及雙菌接種處理與對照物無顯著差異(圖3B)。另外，單播的紫花苜蓿的SPAD值顯著高于混播(|t|=4.491，P=0.0206)，而混播中無芒雀麥的SPAD值顯著高于單播(|t|=4.605，P=0.0193)。

圖3 不同接種處理對單播和混播中的紫花苜蓿和無芒雀麥SPAD值的影響Fig.3 Effects of different inoculation treatments on SPAD values of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing

2.4 不同接種處理對混播系統(tǒng)紫花苜蓿根瘤數(shù)量的影響

由圖4可知，接種根瘤菌處理的紫花苜蓿根系根瘤菌數(shù)量遠遠高于不接種根瘤菌的處理，如單播的紫花苜蓿的根瘤菌數(shù)量在R和FR處理分別為60.33和38.00個·株-1，在CK和F處理下分別為2.33和3.00個·株-1。同樣混播中的紫花苜蓿的根瘤菌數(shù)量在R和FR處理分別為43.00和51.67個·株-1，在CK和F處理下分別為2.33和3.00個·株-1；在R處理下紫花苜蓿的根瘤菌數(shù)量在單播和混播之間無顯著差異，在FR處理下混播中的紫花苜蓿的根瘤菌數(shù)量極顯著高于單播(P<0.01)。

圖4 不同接種處理對單播和混播中的紫花苜蓿根瘤菌數(shù)量的影響Fig.4 Effects of different inoculation treatments on the number of rhizobia in alfalfa in pure sowing and mixed sowing注：**表示單播與混播之間差異極顯著(P<0.01)Note:** indicated that there was a significant difference between pure sowing and mixed sowing at the 0.01 level

2.5 不同接種處理對混播系統(tǒng)牧草生物量的影響

與對照相比，單獨接種根瘤菌(R)和同時接種根瘤菌和菌根真菌(FR)處理對單播紫花苜蓿單株地上干物質生物量(DMY)均具有顯著影響(圖5A，P<0.05)；單獨接種菌根真菌(F)對單播的紫花苜蓿單株地上干物質生物量具有促進作用，但未達到顯著水平；與單獨接種菌根真菌(F)處理相比，同時接種根瘤菌和菌根真菌(FR)處理下單播的紫花苜蓿的單株地上干物質生物量顯著增加(圖5A，P<0.05)。在混播中同時接種根瘤菌和菌根真菌(FR)處理下紫花苜蓿單株干物質生物量顯著高于對照和單獨接種菌根真菌(F)處理(P<0.05)，但在CK，R和F處理之間無顯著差異(圖5A)。

在單播和混播處理中，單獨接種根瘤菌(R)和同時接種根瘤菌和菌根真菌(FR)處理下紫花苜蓿單株地下干物質生物量顯著高于對照和單獨接種菌根真菌處理(F)(P<0.05)，F(xiàn)處理顯著高于對照(圖5C，P<0.05)，而在單播中FR處理顯著高于R處理(P<0.05)，在混播中無顯著差異。在單播和混播處理中，接種菌根真菌處理(F)的無芒雀麥單株地上和地下干物質生物量顯著高于對照(圖5B和圖5D，P<0.05)。另外，混播中紫花苜蓿的單株地上和地下干物質生物量均顯著低于單播中的紫花苜蓿(表1，P<0.0001)，而混播中的無芒雀麥的單株地上和地下干物質生物量卻顯著高于單播中的無芒雀麥(表1，P<0.0001)。

圖5 不同接種處理對單播和混播中的紫花苜蓿和無芒雀麥干物質生物量的影響Fig.5 Effects of different inoculation treatments on dry matter biomass of individual alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing注：A和B分別代表紫花苜蓿和無芒雀麥的地上干物質生物量；C和D分別代表紫花苜蓿和無芒雀麥的地下干物質生物量。Note:Fig. A and B represent the aboveground dry matter biomass of alfalfa and smooth brome respectively,and C and D represent the belowground dry matter biomass of alfalfa and smooth brome respectively.

在單播種植的紫花苜蓿的單株地上生物量顯著高于混播種植(|t|=4.491，P=0.0206)，單株地下生物量高于混播種植，但未達到顯著水平(|t|=3.113，P=0.0527)?；觳シN植的無芒雀麥的單株地上和地下生物量顯著高于單播種植(地上生物量：|t|=5.426，P=0.0123；地下生物量：|t|=3.304，P=0.0456)。

在對照(CK)和單獨接種菌根真菌(F)處理下，紫花苜蓿和無芒雀麥混播的地上和地下總生物量顯著高于紫花苜蓿，卻顯著低于無芒雀麥。在接種根瘤菌的處理中(包括R和FR處理)，紫花苜蓿和無芒雀麥混播的地上總生物量卻顯著低于紫花苜蓿和無芒雀麥單播時的地上總生物量(圖6A，P<0.05)。在同時接種根瘤菌和菌根真菌(FR)處理下，紫花苜蓿和無芒雀麥混播的地上和地下總生物量顯著低于紫花苜蓿和無芒雀麥單播時的地上和地下總生物量(圖6B，P<0.05)。

圖6 不同接種處理對單播和混播中的紫花苜蓿和無芒雀麥總生物量的影響Fig.6 Effects of different inoculation treatments on the total biomass of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing

3 討論

不論何種接種處理，紫花苜蓿的生長(主要包括株高、分枝數(shù)、SPAD值、地上和地下單株生物量)在單播種植中總是優(yōu)于混播種植，而無芒雀麥與之相反，在混播種植中總是優(yōu)于單播種植[16]。主要原因可能是在混播中豆科植物對伴生植物地下氮素的轉移，導致混播中禾本科牧草生物量產量要高于單播的禾本科牧草[17-18]。另外，不論是地上還是地下總生物量，混播種植的生物量總是介于兩種牧草單播生物量之間，這與以前的研究結果一致[19]。Trenbath研究了344個二元結構的混播的產量，數(shù)據(jù)顯示混播草地的產量一般介于兩個物種單播的生物量之間，但高于兩種單播模式產量的均值[20]。Sturludóttir研究也表明通常情況下在豆禾混播草地中混播的產量都會小于高產單播的產量[21]。

本研究中，與對照相比，單獨接種根瘤菌處理下單播和混播種植的紫花苜蓿地上單株生物量分別提高了65.42%和53.41%，地下單株生物量分別提高了96.66%和114.42%，這與寧國贊研究結果一致[22]。單獨接種菌根真菌顯著促進了單播和混播種植的紫花苜蓿的生長，特別是地上單株生物量分別提高了35.33%和23.20%，地下單株生物量分別提高了40%和46.45%，其主要原因可能是接種根瘤菌可顯著提高豆科植物的生物固氮量，AMF提高植物吸收磷和其他養(yǎng)分的能力[6，23]。菌根真菌和根瘤菌雙接種處理也顯著促進了單播和混播種植的紫花苜蓿的生長，其中地上單株生物量分別提高了105.66%和185.64%，地下單株生物量分別提高了167%和121%。因此，本研究認為同時接種AMF和根瘤菌對紫花苜蓿促進作用具有協(xié)同效應。Abd-Alla等研究也表明AMF和根瘤菌雙重接種對促進蠶豆(V.fabaL.)的生長更為有效[24]。AMF與根瘤菌雙接種對宿主的促進效果優(yōu)于單接種，主要是因為雙接種能明顯促進宿主植物生長，改善其養(yǎng)分利用狀況(特別是磷素)[25-26]，提高土壤有機磷的利用率和根瘤菌的固氮能力[6]，并最終促進宿主植物的生長發(fā)育[27-29]。

與對照相比，菌根真菌和根瘤菌雙接種處理下單播和混播種植的無芒雀麥地上單株生物量分別提高了44.39%和48.82%，地下單株生物量分別提高了24.18%和15.22%。而單獨接種菌根真菌處理下單播和混播種植的無芒雀麥地上單株生物量分別提高了33.78%和43.40%，地下單株生物量分別提高了43.40%和65.05%?？梢婋p接種對無芒雀麥的生長沒有明顯的協(xié)同促進作用，主要是因為接種根瘤菌對無芒雀麥的生長沒有影響，這與Meng等在玉米上的研究結果不一致，他的研究認為接種根瘤菌對間作中的玉米也存在顯著的促進作用，其主要原因是植物根際促生根瘤菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)可增強非固氮植物非共生性N2固定、養(yǎng)分吸收以及與有害微生物的競爭力[10，30-31]。植物根際促生菌對植物的促進作用主要是由于該菌群能促進植物根系的生長發(fā)育，進而促進植物對土壤中水分和礦質養(yǎng)分的吸收利用所致[32]，在本研究中供試土壤經過滅菌后再接種處理，土壤中的微生物主要為接種的根瘤菌或菌根真菌，比較單一的菌群可能是造成對無芒雀麥沒有促進作用的主要原因。

4 結論

在豆禾混播草地中，菌根真菌和根瘤菌雙接種對紫花苜蓿的生物量的促進作用具有協(xié)同效應，對無芒雀麥的生物量沒有明顯的協(xié)同促進作用。叢枝菌根真菌(AMF)和根瘤菌能夠與豆科植物和禾本科植物建立有益的共生關系，有利于豆科植物和禾本科植物的生長，可以增強混播優(yōu)勢，提高牧草產量。