核桃蛋白的組成、制備及特性研究進展

豁銀強 劉傳菊 聶榮祖 周 睿 包鴻慧 湯尚文

(湖北文理學院，襄陽 441053)

核桃是世界上種植面積最廣的木本堅果，主要種植區(qū)域分布在南歐、北非、東亞、美國及南美西部[1]。從FAO統(tǒng)計數(shù)據(jù)來看，核桃種植面積不斷增加，從1998年的561 977 ha到2018年的1 159 484 ha，10年間種植面積增加了1倍多。2018年世界核桃總產(chǎn)量為3 662 507 t，中國是世界上核桃產(chǎn)量最多的國家，年產(chǎn)量達到1 586 367 t，隨后是美國、伊朗和土耳其，年產(chǎn)量分別為613 260、409 562和215 000 t。核桃仁的營養(yǎng)成分主要是油脂和蛋白質(zhì)，分別占干物質(zhì)的55%～70%和18%～24%[2,3]。核桃蛋白含18種氨基酸，包括人體所需的8種必需氨基酸，核桃蛋白的氨基酸組成非常平衡，顯示出一系列營養(yǎng)與保健功能。核桃蛋白主要是核桃油生產(chǎn)加工的副產(chǎn)物，由于主要組分谷蛋白的溶解性差，核桃蛋白在食品領域的應用非常有限，大多作為飼料或被廢棄，造成了核桃蛋白資源的極大浪費。為了提高核桃蛋白的溶解性，擴大其在食品領域中的應用，人們從生產(chǎn)工藝、蛋白改性等方面進行了系列的研究。

1 核桃蛋白質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)

1.1 核桃蛋白質(zhì)組成

根據(jù)溶解性差異，核桃蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其分別占總蛋白的6.8%、17.6%、5.3%和70.1%[4]，谷蛋白是核桃蛋白質(zhì)的主要組分。在非還原SDS-PAGE圖譜上，核桃蛋白呈現(xiàn)9條明顯的條帶。在還原SDS-PAGE圖譜上，核桃蛋白呈現(xiàn)至少11條不同的條帶，在分子質(zhì)量20、31 ku和40 ku附近的條帶比較明顯，一些染色較弱的條帶出現(xiàn)在分子質(zhì)量14.4～66.2 ku之間。非還原SDS-PAGE圖譜上，主要的條帶出現(xiàn)在分子質(zhì)量40～60 ku之間，其是分子質(zhì)量40～45、20～25 ku及25～30 ku的多條肽鏈通過二硫鍵連接的多肽鏈蛋白。在還原和非還原SDS-PAGE圖譜上31～43 ku之間均出現(xiàn)一個染色弱的條帶，表明該條帶之間沒有鏈間二硫鍵[5]。在還原SDS-PAGE圖譜上，白蛋白在分子質(zhì)量10～75 ku區(qū)出現(xiàn)比較寬廣的條帶分布，主條帶出現(xiàn)在分子質(zhì)量20.1 ku；球蛋白條帶主要出現(xiàn)在30～35 ku和17～22 ku之間，其可能分別是11S glycinin的酸性亞基和堿性亞基，在50～72 ku區(qū)間的條帶主要是7 S conglycinin 蛋白；谷蛋白主要包括分子質(zhì)量大于200、50～60、30～35 ku和17～20 ku四種類型的條帶[6]。醇溶蛋白在還原和非還原SDS-PAGE圖譜上均未出現(xiàn)明顯的條帶[5]。核桃蛋白粉、核桃蛋白濃縮物及核桃蛋白分離物的SDS-PAGE圖譜沒有明顯的差異，表明堿提等電點沉淀對核桃蛋白質(zhì)的組成沒有明顯的影響[7]。

利用高效液相排阻色譜對核桃蛋白進行分析表明，核桃蛋白粉主要包括18 824、96.99 ku和3.83 ku三種分子大小組分，其中分子質(zhì)量18 824 ku的組分可能是蛋白分子聚集體。核桃蛋白濃縮物含16 725、104.943、7.3 ku和2.6 ku四種分子大小的組分，其比例分別為0.8%、63.9%、11.4%和23.9%。核桃蛋白分離物主要包含1種分子質(zhì)量106.33 ku的組分[7]，堿法制備過程中亞基間的二硫鍵被破壞，因而沒有出現(xiàn)大分子聚集體[8]。

1.2 核桃蛋白質(zhì)氨基酸組成

氨基酸組成是蛋白質(zhì)的重要化學特征，決定它的營養(yǎng)價值?？赡苁怯捎谄贩N間的差異，不同文獻報道核桃蛋白的氨基酸組成略有不同。由于制備方法不同，核桃蛋白粉、核桃蛋白濃縮物及核桃蛋白分離物的氨基酸組成也存在一定的差異。表1為核桃蛋白粉、核桃蛋白濃縮物和核桃蛋白分離物的氨基酸組成[7]。核桃粉的賴氨酸和苯丙氨酸含量高于核桃蛋白濃縮物和核桃蛋白分離物，這可能是由于制備過程中破壞了一些氨基酸殘基。核桃蛋白產(chǎn)品均含有較高的谷氨酸，其次是精氨酸和天冬氨酸，其含量分別達到22.94、10.14、14.88 g/100 g脫脂蛋白[9]。相比于FAO/WHO對成年人的推薦模式，核桃蛋白僅甲硫氨酸含量不足，可見對成年人而言核桃蛋白是一種良好的必需氨基酸源，也是具有高營養(yǎng)價值的植物蛋白源[10]。相比于FAO/WHO推薦模式，核桃分離物的組氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸均超過了2～5歲學前兒童的需要標準，而賴氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的含量僅為需求量的43.1%～94.1%，賴氨酸是核桃蛋白分離物的第一限制氨基酸，其含量僅為推薦量的43.1%～44.8%[11]。

表1 核桃蛋白粉、核桃蛋白濃縮物和核桃蛋白分離蛋白的氨基酸組成(g/100 g蛋白)[7]

1.3 核桃蛋白的二級結(jié)構(gòu)

脫脂核桃粉與核桃蛋白濃縮物及核桃蛋白分離物的遠紫外圓二色譜圖有所不同。通過擬合分析，脫脂核桃蛋白粉二級結(jié)構(gòu)組成中α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的含量分別為80.4%、4%、5.7%和15.3%。核桃蛋白濃縮物和核桃蛋白分離物的二級結(jié)構(gòu)組成類似，其α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的含量分別為34.9%、11%、23.3%和32%[8]。由于提取過程中對蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞，相對于脫脂核桃蛋白粉來說，核桃蛋白濃縮物和核桃蛋白分離物含有更多的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，而結(jié)構(gòu)緊密的α螺旋結(jié)構(gòu)含量相對較低。Zhu等[12]研究核桃蛋白分離物時得到類似的結(jié)果，即α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的含量分別是35.9%、11.3%、23.4%和29.4%，超聲處理使α螺旋結(jié)構(gòu)減少而β折疊、β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的含量均不同程度增加。提取方法對核桃蛋白二級結(jié)構(gòu)也有一定的影響，相對于常規(guī)堿法提取，超聲輔助堿法提取使核桃蛋白分離物的α螺旋含量降低，而β轉(zhuǎn)角、β折疊及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量均增加[11]。水提白蛋白的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量分別為27.8%、53.65%、0%和18.55，5%NaCl提取球蛋白的四種結(jié)構(gòu)分別為14.49%、37.32%、26.90%和21.29%，75%乙醇提取醇溶蛋白的分別為35.68%、30.09%、18.70%和15.52%，0.1 mol/L NaOH提取谷蛋白的四種結(jié)構(gòu)分別為17.38%、41.89%、30.64%和10.06%。利用二(2-乙基已基)丁二酸酯磺酸鈉反膠束提取白蛋白的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的含量分別為28.18%、37.61%、12.05%和22.15%，球蛋白的為32.17%、26.06%、12.10%和35.78%，醇溶蛋白的為36.16%、36.40%、14.41%和13.04%，谷蛋白的為11.35%、41.25%、20.44%和26.95%[13]。

2 核桃蛋白的制備

核桃蛋白主要利用提取油脂產(chǎn)生的副產(chǎn)物核桃粕進行加工制備。根據(jù)蛋白質(zhì)含量不同，核桃蛋白分為3大類：蛋白含量小于60%的核桃蛋白粉、蛋白含量高于70%的核桃濃縮蛋白及蛋白含量高于90%的核桃分離蛋白[14]。

2.1 核桃蛋白粉

核桃蛋白粉主要是提取油脂后產(chǎn)生的副產(chǎn)物經(jīng)干燥及微細化等處理獲得的高蛋白產(chǎn)品。常用制備油脂的方法有液壓擠壓、螺桿擠壓、有機溶劑、超臨界CO2浸提，以及先壓榨然后再用溶劑浸提的聯(lián)用方式[15]。不同方式所得蛋白粉的蛋白質(zhì)含量及油脂殘留量不同。相對物理壓榨來說，溶劑浸提所得蛋白粉的油脂殘留量低而蛋白質(zhì)含量高，螺桿擠壓所得蛋白粉比液壓擠壓所得產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量高而油脂殘留低。液壓擠壓聯(lián)合溶劑浸提或固液浸提能進一步提高蛋白質(zhì)的含量而降低油脂的殘留量，其蛋白含量與直接溶劑提取相當[16]。油脂含量越低，蛋白粉的白度越高而色度越好。液壓擠壓溫度較高時，酚類物質(zhì)發(fā)生氧化及還原糖與氨基發(fā)生美拉德反應使顏色加深。由于在提取油脂過程中所受機械力、溫度及處理強度不同，所得蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)也有所差異。

2.2 核桃蛋白濃縮物

通常利用脫脂蛋白粉進行制備植物蛋白濃縮物，一般采用乙醇浸提、酸浸出及濕熱使蛋白質(zhì)變性，然后經(jīng)水洗去除灰分、寡糖及一些微量組分，從而提高蛋白質(zhì)的純度。蛋白質(zhì)和多糖不溶于乙醇溶液，利用60%～95%的乙醇洗滌脫脂蛋白粉去除小分子糖類及其他可溶性化合物，然后經(jīng)干燥得蛋白濃縮物。酸浸出法是利用與主要蛋白組分等電點pH相同的酸性溶液洗滌脫脂蛋白粉，去除小分子糖及一些可溶性微量組分，然后經(jīng)中和、干燥得到蛋白濃縮物。通過濕熱使脫脂蛋白粉中的蛋白質(zhì)變性降低其溶解度，然后進行水洗去除小分子糖及其他可溶性組分，獲得蛋白濃縮物。這些方法通常能使蛋白質(zhì)含量達到70%以上，但不同方法制備蛋白濃縮物的物理特性差異較大。酸浸出法獲得的蛋白濃縮物溶解度比乙醇浸提及濕熱-水洗法制備的高。由于濃縮過程中去除了一些風味物質(zhì)及色素組分，蛋白濃縮物的色澤和風味比蛋白粉好。周苗苗在優(yōu)化條件下利用乙醇浸提核桃濃縮蛋白的提取率達87.07%，蛋白含量為69.24%[14]。

2.3 核桃蛋白分離物

蛋白分離物是精制程度最高的蛋白產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)達90%以上，其在去除蛋白質(zhì)濃縮物制備過程中的小分子糖及可溶性微量組分外，還將一些不溶性多糖去除。主要采用堿性溶液浸提脫脂蛋白粉，去除包括不溶性多糖及蛋白等不溶性成分。將含有大多數(shù)蛋白及小分子糖的上清液pH調(diào)至4.5左右使蛋白質(zhì)沉淀，通過離心或過濾去除含有小分子糖、灰分及其他微量組分的上清液。沉淀經(jīng)洗滌、干燥得蛋白分離物。通常在干燥之前對蛋白進行中和，該法獲得的蛋白質(zhì)分離物在水中的分散性較好。邸紅艷等利用超聲輔助堿法提取核桃蛋白的得率達到71%[17]。

3 核桃蛋白功能特性

3.1 溶解性

溶解性是蛋白質(zhì)的重要功能特性，其對蛋白質(zhì)乳化特性、發(fā)泡特性等有重要影響。pH、溶劑類型和溫度等因素對核桃蛋白質(zhì)的溶解性有較大影響。核桃蛋白在堿性溶液中的溶解度較高，在70%乙醇溶液中的溶解度最低，在55 ℃時的溶解度最大[4]，溫度超過55 ℃后，由于蛋白質(zhì)變性溶解度會逐漸下降[18]。核桃中的酚醛類物質(zhì)通常能與蛋白質(zhì)形成復合物，進而降低核桃蛋白在水及稀鹽溶液中的溶解度[19]。通過熱水處理去除核桃中的單寧，脫脂核桃粉的球蛋白溶出率從15%提高至20%，表明球蛋白因與單寧發(fā)生復合溶解度降低[20]。

3.2 乳化特性

核桃蛋白的乳化性與溶解度密切相關，并受蛋白質(zhì)濃度、溫度等外界條件影響。核桃蛋白質(zhì)在堿性溶液中乳化性較好，在等電點乳化性最差，在0～0.5 mol/L NaCl的溶液中，乳化性隨鹽溶液濃度升高而增加，在0.5～1 mol/L NaCl 溶液中，乳化性隨鹽溶液濃度升高而減弱[21,22]。制備方法對乳化特征也有一定的影響，相對于常規(guī)堿法處理，超聲輔助堿法制備核桃蛋白分離物的乳化性提高34.5%[11]。

3.3 其他特性

目前，關于核桃蛋白質(zhì)功能特性方面的研究主要集中在溶解性和乳化性方面，其他功能特性研究報道比較少。丁曉雯等[23]發(fā)現(xiàn)核桃蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性、黏度、熱穩(wěn)定性、持水力等功能性質(zhì)受溫度、加熱時間及pH的影響。核桃蛋白的持水力、起泡性和泡沫穩(wěn)定性在pH5.0時最弱；當 NaCl 濃度為 0.6 mol/L，核桃蛋白在40 °C時的持水力最強；NaCl能提高發(fā)泡力，但會使泡沫的穩(wěn)定性降低。

4 核桃蛋白的改性

核桃蛋白因溶解性差，進而導致其乳化性、發(fā)泡性、膠凝性等功能特性不佳，限制了其在食品領域的應用。為了拓展核桃蛋白在食品及其他領域中的應用，需要對其進行改性以提高其功能特性，進而開發(fā)具有不同功能特性的專用核桃蛋白產(chǎn)品。

4.1 物理改性

物理改性是指通過超聲、剪切、輻照、高壓、電場及添加小分子雙親物質(zhì)等方法來改善蛋白質(zhì)的功能特性。物理改性具有成本低、無毒副作用、對營養(yǎng)價值影響小及易于工業(yè)化實施等優(yōu)點，目前越來越受人們的青睞。高強度超聲處理不會破壞核桃蛋白分離物的共價鍵，但使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生解聚、伸展，導致其變性溫度和變性焓降低。由于引起聚集體解聚及空間結(jié)構(gòu)改變，高強度超聲處理使核桃蛋白分離物的溶解度、乳化活性指數(shù)及乳化穩(wěn)定性均提高[12]。在60 °C溫度下15 000 r/min高速剪切5 min使核桃蛋白在pH 8.0和pH 9.0溶液中的溶解度分別從24.33%增加到62.81%和50.93%增到76.65%，同時伴隨著粒徑減小[24]。電子束輻照使核桃蛋白分子發(fā)生聚集或交聯(lián)，導致其變性溫度升高及熱穩(wěn)定增加[25]。

4.2 化學改性

化學改性是通過化學手段在蛋白質(zhì)中引入各種功能基團，如親水親油基團、二硫鍵、帶負電荷基團等。利用蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團的化學活性改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、靜電荷和疏水性，以此達到改善蛋白質(zhì)功能特性的目的。關于核桃蛋白化學改性的報道相對較少。傳統(tǒng)加熱和超聲兩種方式對核桃分離蛋白進行麥芽糊精接枝改性均能提高核桃蛋白分離物的溶解度、乳化性及乳化穩(wěn)定性，超聲輔助能增加核桃蛋白分離物的接枝度。脂質(zhì)過氧化物、烷過氧自由基(ROO·)、丙烯醛氧化修飾均使核桃蛋白質(zhì)發(fā)生聚集、空間結(jié)構(gòu)無序化程度增加，進而導致其溶解度、乳化性及乳化穩(wěn)定性降低[26-28]。

4.3 酶法改性

酶法改性通過酶作用使蛋白質(zhì)發(fā)生降解或交聯(lián)聚合，進而改善蛋白質(zhì)的功能特性，酶法改性是目前核桃蛋白改性研究的重點。Alcalase 堿性蛋白酶對核桃分離蛋白進行酶解有效提高了核桃蛋白分離物的氮溶解指數(shù)，改善了其發(fā)泡、泡沫穩(wěn)定性、乳化、乳化穩(wěn)定性及吸油性和吸水性等功能特性[29]。采用Trypsin 和 Alcalase對核桃蛋白分離蛋白進行水解時發(fā)現(xiàn)，水解產(chǎn)物的溶解度隨水解度增加而提高，Trypsin 水解產(chǎn)物的乳化性及乳化穩(wěn)定性得到顯著提高[30]。采用胰蛋白酶水解脫脂核桃蛋白粉，底物與胰蛋白酶的比例為20∶1、pH 8.0、溫度55 ℃、水解12 h獲得多肽具有良好的羥基自由基清除、氧自由基吸收能力及與谷胱甘肽和腦活素相當?shù)?H2O2誘導PC12 細胞損害的保護功能，同時表現(xiàn)出改善記憶和學習的功能[31]。采用Alcalase和Trypsin對核桃蛋白進行水解，水解所得的肽具有較好的抗氧化及抗高血壓活性[32]。采用中性蛋白酶對核桃餅粕進行水解制備核桃餅粕蛋白多肽對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有較好的抑菌效果，且多肽分子質(zhì)量越小抑菌性越強[33]。

5 核桃蛋白的開發(fā)與應用

核桃蛋白在食品領域中的應用還比較有限，其主要被開發(fā)成核桃乳、核桃粉、核桃多肽等產(chǎn)品，以及作為特殊功能性成分的食品配料。

核桃乳一般分為用未脫脂的核桃仁加工的全脂核桃乳和去除全部油脂后的核桃蛋白制成的脫脂核桃乳。其中，全脂核桃乳因其含油量較高容易分層，脫脂核桃乳因油脂含量較低則比較穩(wěn)定。核桃乳生產(chǎn)的主要技術(shù)難題是體系不穩(wěn)定，通常需要添加穩(wěn)定劑、乳化劑和增稠劑。劉淼等[34]將溶劑法提取油后的核桃漿液經(jīng)過浸提后溶出大量蛋白質(zhì)，通過添加復配的乳化劑和穩(wěn)定劑，獲得了較好穩(wěn)定性的乳液。郝艷賓等[35]以核桃仁為原料，經(jīng)脫皮、破碎、壓榨等工藝提取部分核桃油，再將去除油脂后的核桃仁打漿、調(diào)配、均質(zhì)和殺菌等工藝制成核桃蛋白飲料。通過添加紅棗能增加核桃乳的營養(yǎng)價值[36]，以及通過發(fā)酵制備核桃酸乳等[37]。

核桃粉分為全脂型和低脂型兩種。低脂型核桃粉含油少，因此保質(zhì)期長；全脂型核桃粉含有較高的油脂，因此保質(zhì)期短。速溶不完全及保質(zhì)期短是核桃粉產(chǎn)品的主要技術(shù)難題，因此，核桃粉的開發(fā)研究以低脂核桃粉為主，采用不同干燥技術(shù)對除油后的核桃粕進行加工制備核桃粉產(chǎn)品。利用4號溶劑浸出核桃油制備低溫核桃粕，然后通過噴霧干燥制取速溶核桃粉[38]。對4號溶劑浸油后的低溫脫脂粕進行超微粉碎，由于粒徑小，不僅可作為食品添加，亦可用于制作香味濃郁、極富營養(yǎng)的保健低脂蛋白粉[39]。核桃多肽具有易消化吸收、抗氧化等特性，此外，因其具有良好的溶解性，也可作為高蛋白類流體食品的理想原料與添加劑，是生產(chǎn)功能性食品的原料[18]。

通常采用酶解生產(chǎn)核桃蛋白多肽。不同的酶制劑酶解核桃蛋白制備的核桃多肽在功能性方面有較大差異。姜莉等[18]研究了三種蛋白酶對核桃蛋白質(zhì)水解的能力，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶的水解能力最強，木瓜蛋白酶的水解能力最弱，酶解物核桃多肽在乳化性、起泡性、吸油性等方面都優(yōu)于核桃蛋白質(zhì)。李艷伏[40]用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解核桃蛋白制備核桃多肽，具有較好的功能特性和抗氧化能力。

將核桃蛋白作為功能性成分加入其他食品中的研究比較少。國外研究主要集中在肉類加工制品中加入核桃脫脂粉、核桃仁來改善肉制品的感官特性、營養(yǎng)價值等[41,42]，以及改善肉制品如肉糜的理化特性、乳化性和流變特性[43,44]。