不同施肥處理條件下閩楠葉片精油組分GC/MS鑒定分析

董 翔 何功秀 文仕知 劉 麗 何含杰 張黨權(quán)

(水土保持與荒漠化防治湖南省高校重點實驗室；中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院1，長沙 410004)(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院2，鄭州 450002)

閩楠[Phoebebournei(Hemsl.)Yang]，俗稱楠木，樟科楠屬常綠大喬木，是中國特有珍貴用材樹種、國家二級瀕危保護(hù)植物[1]，閩楠和楨楠、紫楠并稱為業(yè)界傳統(tǒng)“金絲楠”的三大載體，是建筑、家具、雕刻和精密木模等的高級用材，也是優(yōu)良的庭院觀賞樹種[2]。由于野生資源的掠奪式采伐利用，導(dǎo)致資源日趨衰竭，價值迅速提升，人工林發(fā)展較快，由于成材期長[3]，在成材期內(nèi)對其各部位精油進(jìn)行開發(fā)利用，可以在不影響其生長的同時提高其經(jīng)濟(jì)價值。研究人員已從閩楠、楨楠等葉片精油中檢測出β-欖香烯、反式石竹烯等大量香料和藥用類物質(zhì)[4]。有研究表明β-欖香烯具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保護(hù)心血管、防治腫瘤、改善免疫功能等作用[5]，反式石竹烯可以抑制腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞炎癥[6]。閩楠葉片精油產(chǎn)率低、品質(zhì)良莠不齊成為制約閩楠精油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題[7]。

精油是芳香植物花、葉、莖、嫩枝、樹皮等部位的次級代謝產(chǎn)物，可通過壓榨、蒸餾、萃取等方法獲得[8,9]。精油的產(chǎn)率、品質(zhì)與植物的遺傳背景，生長環(huán)境和提取工藝等息息相關(guān)[10]。通過對幾種近緣植物甜蕎麥、苦蕎麥和金蕎麥進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取精油，發(fā)現(xiàn)苦蕎麥精油含量明顯較高[11]。采用微波輔助法提取黑藻種子揮發(fā)油，精油產(chǎn)率較傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法高出0.1%[12]，以粉碎-絕氧陳化-紫外線激活的方法，可以提高柑橘香精油中的含氧萜烯類含量的相對含量，提升精油品質(zhì)[13]，但這些方法儀器設(shè)備昂貴、流程復(fù)雜、成本較高。有研究人員發(fā)現(xiàn)配合施用牛糞和NPK3-12-6并覆蓋塑料膜可以大幅提高香葉天竺葵精油的產(chǎn)量[14]，施營養(yǎng)液會影響迷迭香中精油的含量和品質(zhì)[15]，表明施肥能改善精油產(chǎn)率和品質(zhì)，且生態(tài)環(huán)境友好，成本低，易于推廣。本研究以湖南金洞林場5年生閩楠為對象，利用水蒸氣蒸餾法和GC-MS分析，研究不同施肥處理下閩楠葉片精油的產(chǎn)率和揮發(fā)性成分差異，探索施肥提升閩楠葉片精油含量與品質(zhì)的規(guī)律，為其精油的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葉片采自湖南省永州市金洞區(qū)金洞林場5年生閩楠，每個處理設(shè)置3塊10 m×20 m的樣地，每塊樣地的坡度、坡位均相似，樣地間間隔一行樹木，每塊樣地30株樹。2018年9月1日人工除草后，將12塊樣地分為4組，分別進(jìn)行環(huán)施有機(jī)肥1 kg/株、復(fù)合肥400 g/株、菌肥20 g/株和不施肥處理，施肥濃度選擇林場施肥管理常用的濃度。90 d后，采取五點取樣法隨機(jī)采集各樣地閩楠的葉片，混合，洗去葉片表面灰塵雜質(zhì)，自然風(fēng)干后，打粉備用。室內(nèi)實驗于2018年12月8日—10日在經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)和草原局重點實驗室完成。GC/MS鑒定與分析由湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院完成。

1.2 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜儀GC7890B-MS5975C，智能恒溫加熱套，超純水機(jī)。

無水乙醇(分析純)，去離子水，無水硫酸鈉(分析純)，1.5 mL離心管，有機(jī)肥(氮磷鉀5%，有機(jī)質(zhì)45%)，復(fù)合肥(氮15%，磷15%，鉀15%)，菌肥(復(fù)合芽孢桿菌)。

1.3 精油水蒸氣蒸餾法提取

提取方法參照朱麗云等[16]、毛運芝等[17]方法并進(jìn)行改進(jìn)，取300 g閩楠葉片樣品粉末放入5 L蒸餾瓶中，加入2 400 mL去離子水(料液比1∶8)，采用水蒸氣蒸餾裝置100 ℃提取7 h,加裝冷凝回流裝置和收集裝置，收集裝置中水液面上方一層淡黃色油狀物，即為樣品精油，提取完畢待管壁冷卻后，用移液器將精油移至1.5 mL離心管中，4 ℃密封保存。精油產(chǎn)率計算方法[18]：閩楠精油產(chǎn)率=精油體積/閩楠葉質(zhì)量×100%，取平均值即為精油產(chǎn)率。

1.4 精油檢測方法與條件

前處理：移液器吸取無水乙醇1 mL至1.5 mL離心管中，再吸取20 μL精油伸入乙醇液面下，將精油推入，搖勻，加入適量無水硫酸鈉，搖晃半分鐘左右，靜止3 h，8 000 r/min離心2 min，取700 μL送檢。

精油檢測：參照丁文等[19]方法對四種施肥處理的閩楠葉片精油進(jìn)行GC-MS檢測，對檢測條件進(jìn)行了改動和優(yōu)化。

色譜分離條件：色譜柱為Agilent-HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口250 ℃；載氣為高純氦氣；柱溫箱升溫程序則是初始溫度50 ℃，以5 ℃/min升到130 ℃，再以2 ℃/min升到155 ℃，8 ℃/min升到180 ℃，10 ℃/min升到250 ℃；分流比20∶1。

質(zhì)譜檢測條件：離子源為EI；電離能70 eV；輔助加熱區(qū)280 ℃；離子源230 ℃；四級桿150 ℃；采集模式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍35～550(m/z)；溶劑延遲3 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

閩楠葉片精油經(jīng)GC-MS檢測后，采用化合物譜庫(NIST17)進(jìn)行分析，得出各峰的物質(zhì)和匹配度，統(tǒng)計各峰匹配度大于90%的物質(zhì)，并參考保留時間確定物質(zhì)，繪制表格。采用色譜峰面積歸一化法，并參照卞京軍等[20]方法進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)與統(tǒng)計分析及表格繪制采用Excel 2016完成，離子流量圖及柱狀圖繪制采用Origin 9.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 閩楠葉片精油產(chǎn)率分析

由表1可知，閩楠葉片精油產(chǎn)率分別為有機(jī)肥處理0.095 7%，復(fù)合肥處理0.085 0%，菌肥處理0.070 9%，不施肥處理0.076 7%。有機(jī)肥處理組的閩楠葉片精油產(chǎn)率最高，較不施肥處理組提高24.77%、較復(fù)合肥處理組的精油產(chǎn)率提高12.59%。菌肥處理組的精油產(chǎn)率最低，較不施肥處理組低7.56%。四種處理精油均為淡黃色油狀，其中復(fù)合肥處理組顏色最深，菌肥處理組顏色最淺，表明閩楠葉片精油中某些與顏色相關(guān)的成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)以復(fù)合肥處理最高，菌肥處理最低。

表1 四種施肥處理閩楠葉片精油產(chǎn)率及性狀

2.2 精油揮發(fā)性成分組成

經(jīng)GC-MS分析得到4種施肥處理的閩楠葉片精油總離子色譜圖(圖1)，共鑒定出83種揮發(fā)性成分，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的主要化學(xué)成分如表2所示。其中有機(jī)肥處理精油中共檢測出67種揮發(fā)性成分，主要物質(zhì)有牛兒烯(14.50%)，(+)-喇叭烯(13.35%)，(-)-α-蒎烯(5.72%)，δ-杜松烯(5.58%)，β-桉葉醇(4.66%)等。復(fù)合肥處理精油中共檢測出72種物質(zhì)，主要物質(zhì)有(+)-喇叭烯(15.67%)，牛兒烯(12.82%)，δ-杜松烯(6.96%)，(-)-α-蒎烯(4.19%)，(+)-香橙烯(4.02%)等。菌肥處理精油中共檢測出65種揮發(fā)性成分，主要物質(zhì)有牛兒烯(16.51%)，(+)-喇叭烯(12.81%)，δ-杜松烯(9.66%)，(+)-香橙烯(5.41%)，蛇麻烯(3.92%)等。不施肥處理精油中共檢測出66種揮發(fā)性成分，主要物質(zhì)有牛兒烯(20.34%)，(+)-喇叭烯(16.28%)，δ-杜松烯(5.02%)，(+)-香橙烯(4.89%)，(-)-α-蒎烯(4.09%)等。

表2 四種施肥處理的閩楠葉片主要精油化學(xué)成分及相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖1 四種施肥處理閩楠葉片揮發(fā)性成分總離子色譜圖

2.3 4種施肥處理的閩楠葉片精油典型組分質(zhì)譜圖分析

參考胡文杰等[21]、邱海燕等[22]研究，以相對含量大于5%為標(biāo)準(zhǔn)，確定閩楠葉片精油典型組分。由表2分析可得，四種施肥處理的閩楠葉片精油中相對含量大于5%的典型組分有5種，分別是：牛兒烯，(+)-喇叭烯，(-)-α-蒎烯，δ-杜松烯，(+)-香橙烯，GC-MS分析得到五種物質(zhì)的質(zhì)譜圖如圖2所示。五種物質(zhì)的分子式均為C15H24，相對分子質(zhì)量為204，與質(zhì)譜圖中顯示的分子離子質(zhì)荷比為204一致。

圖2 閩楠葉片精油典型組分質(zhì)譜圖

2.4 4種施肥處理的閩楠葉片精油品質(zhì)分析

2.4.1 揮發(fā)性成分種類的數(shù)量差異

四種施肥處理90 d后的閩楠葉片精油分離出的揮發(fā)性成分見圖3，共包括烴類47種、醇類17種、醛類8種、萘類6種，酮類3種、酯類1種、呋喃1種。其中，四種處理的葉片精油中相同成分有51種，多數(shù)為萜烯烴類和萜醇類化合物，是閩楠精油芳香氣息的主要來源，表明施肥處理不會造成閩楠葉片精油成分的種類發(fā)生大幅度的變化，但仍有一定的差異。有機(jī)肥提高了烴類、醛類、萘類物質(zhì)的數(shù)量，降低了酮類和呋喃類物質(zhì)的種類；復(fù)合肥提高了烴類、醇類、醛類、萘類物質(zhì)的數(shù)量；而菌肥提高了醇類、萘類物質(zhì)數(shù)量，降低了烴類、酮類物質(zhì)數(shù)量。

圖3 4種施肥處理的揮發(fā)性成分種類的數(shù)量

2.4.2 揮發(fā)性成分種類的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異

4種施肥處理的揮發(fā)性成分種類及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)(圖4)與不施肥組相比，有機(jī)肥和復(fù)合肥均可降低閩楠葉片精油中烴類物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提高醇類、醛類、萘類、酯類物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)；而菌肥則提高了烴類、醛類、呋喃類物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其他類均降低。有機(jī)肥處理、復(fù)合肥處理、菌肥處理和不施肥處理的含氧化合物的總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小分別為19.58%、19.51%、13.07%、17.52%。而精油品質(zhì)優(yōu)劣與含氧化合物含量密切相關(guān)，常用于提升精油品質(zhì)的方法為降低精油中烴類物質(zhì)含量、提高含氧化合物含量[23]。因此，有機(jī)肥與復(fù)合肥處理降低了葉片精油中烴類物質(zhì)含量，提高了含氧化合物的含量；而菌肥處理則提高了烴類物質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低了含氧化合物總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。表明有機(jī)肥與復(fù)合肥處理可以提高閩楠葉片精油品質(zhì)，且有機(jī)肥處理的精油品質(zhì)更高，而菌肥處理會降低精油品質(zhì)。

圖4 四種施肥處理的精油揮發(fā)性成分種類及相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4.3 揮發(fā)性成分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異

由表2可以看出，與不施肥處理相比，有機(jī)肥處理提高了葉片精油中28種物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低了48種物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)；復(fù)合肥處理提高了39種物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低了27種物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)；菌肥處理提高了29種物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低了44種物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。每個處理組相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的六種揮發(fā)性成分比較如圖5所示。四種施肥處理的葉片精油中，牛兒烯和(+)-喇叭烯的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較最高。有機(jī)肥處理的閩楠葉片中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的共檢測出23種，(-)-α-蒎烯、β-桉葉醇和反式石竹烯比其他處理組高，比不施肥處理組分別高1.63%、1.95%、1.73%(圖5a)。復(fù)合肥處理的閩楠葉片中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的共檢測出23種，(-)-α-古蕓烯比其他組高，比不施肥處理高0.71%(圖5b)。菌肥處理的閩楠葉片中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的共檢測出23種，δ-杜松烯、(+)-香橙烯、蛇麻烯和大牛兒烯D均比其他處理組高(圖5c)，比不施肥處理分別高4.64%、0.52%、3.23%、0.54%。不施肥的閩楠葉片中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的共檢測出22種，牛兒烯和(+)-喇叭烯的含量均高于其他處理組(圖5d)。因此，不同施肥處理可以用來提高或降低精油中某些成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可用于定向培育與開發(fā)利用。

圖5 4種施肥處理的揮發(fā)性成分種類及相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討論

在提取工藝方面，本研究改進(jìn)了朱麗云等[16,17]的水蒸氣蒸餾提取方法，調(diào)整料液比從1:6至1:8，以回流速度每秒2～3滴作為參考標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定溫度[24]，采用5 L容量瓶，加入300 g葉片和2.4 L水進(jìn)行提取，在冷凝回流管下方增加了一個定制的虹吸式連通器[25]收集裝置，解決了提取過程中料液比不適宜及加熱套溫度過高導(dǎo)致蒸餾瓶壁易出現(xiàn)焦糊狀物質(zhì)的問題，避免了提取過程由于過滿，容易向上噴涌的安全隱患問題，提高了精油提取精度，減小了精油損耗，并方便觀測和收集。

針對施肥對植物精油含量及品質(zhì)影響方面研究發(fā)現(xiàn)[26-30]，檸檬馬鞭草施用生物肥料能顯著提高精油含量，蒔蘿施用生物肥料和化肥可增加精油中香芹酮含量，互葉白千層施用微量元素硼會降低枝葉精油中1,8-桉葉素的含量，桂花施磷肥則會降低精油中的物質(zhì)種類，而迷迭香精油產(chǎn)量和組分則不受無機(jī)肥和有機(jī)肥的影響。本研究表明，閩楠施有機(jī)肥和復(fù)合肥能明顯提高葉片精油的產(chǎn)率和品質(zhì)，而菌肥會降低產(chǎn)率和品質(zhì)。三種施肥處理的葉片精油中牛兒烯含量均低于不施肥組，表明了牛兒烯作為平臺中間體在施肥后被用于合成了其他活性成分，菌肥處理后可能用于合成了烴類物質(zhì)。因此，通過施肥提高閩楠精油的產(chǎn)率和品質(zhì)，調(diào)控其精油的關(guān)鍵組分產(chǎn)量，對提升閩楠的實際應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值，具有很高的探索和應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

有機(jī)肥、復(fù)合肥、菌肥和不施肥處理90 d的閩楠葉片精油產(chǎn)率分別為0.095 7%、0.085 0%、0.070 9%、0.076 7%。有機(jī)肥和復(fù)合肥可以提高閩楠葉片精油的產(chǎn)率，而菌肥會降低葉片精油產(chǎn)率。

從四種施肥處理的葉片精油中分別檢測出物質(zhì)67種，72種，65種，66種。精油分離出的揮發(fā)性成分共包括烴類47種、醇類17種、醛類8種、萘類6種，酮類3種、酯類1種、呋喃類1種。

四種施肥處理的葉片精油中含氧化合物的總相對含量大小分別為19.58%、19.51%、13.07%、17.52%。有機(jī)肥和復(fù)合肥可以提高閩楠葉片精油的品質(zhì)，而菌肥會降低精油品質(zhì)。

閩楠葉片精油典型組分為牛兒烯，(+)-喇叭烯，(-)-α-蒎烯，δ-杜松烯，(+)-香橙烯。不同施肥處理可以用于改變?nèi)~片精油中成分的種類和相對含量，也可以用于提高特定需求成分或降低有害成分的相對含量，對閩楠進(jìn)行定向培育與開發(fā)利用。