湖南柑橘果皮總黃酮及橙皮苷含量分析

劉嘉麗，劉德明，王 丹，張 鴻，董新榮，童建華

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

中國是世界柑橘產(chǎn)量大國，2018 年全國種植面積達(dá)到260 萬hm2，產(chǎn)量達(dá)到4 138.1 萬t[1]。國內(nèi)柑橘的消費(fèi)主要為鮮食（55%）、榨取果汁及罐頭加工（35%～40%）[2]，其中加工將產(chǎn)生占鮮重45%～60%的柑橘皮渣[3]。柑橘果皮富含黃酮類化合物[4]，有文獻(xiàn)報道柑橘果皮黃酮主要為多甲氧基黃酮[5-6]，也有研究[7-11]認(rèn)為主要成分為橙皮苷。

橙皮苷（hesperidin）是一種二氫黃酮苷，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、防輻射、保護(hù)心血管等藥理活性[12]。橙皮苷在食品工業(yè)中，可用作抗氧化劑、食品添加劑、果蔬高效抗氧保鮮劑等[13]。橙皮苷主要從枳實(shí)中提取分離，國際市場前景廣闊。枳實(shí)為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)[14]。由于產(chǎn)量有限，近年來枳實(shí)的市場價格暴漲，尋求新資源成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

分光光度法具有儀器易得、操作簡單、測定快速等特點(diǎn)[15-16]，在柑橘果皮提取物及應(yīng)用的研究中廣泛使用[17-20]。因樣品顯色方式不同，分光光度法又嗑分為UV 直接比色法、堿顯色比色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色比色法等。但是從植物提取物中分析單一化合物含量最有效的方法是HPLC 法[21-22]。前期比較了橙皮苷（對照樣品）與柑橘果皮提取液在不同顯色方法下的紫外-可見光譜的最大吸收峰波長，認(rèn)為直接比色法和堿液顯色比色法適用于總黃酮的檢測，與伍長春等[18]的研究結(jié)果一致。但考慮到NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法為黃酮含量測定的通用方法，故將該方法一起進(jìn)行比較；另外，采用HPLC 法測定了柑橘果皮中橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷的含量，以期為柑橘果皮的資源化綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試柑橘果皮的產(chǎn)地、采摘時間及品種名稱等信息見表1，所用橙皮苷（批號為P06D9F77001，HPLC含量≥98%）、新橙皮苷（批號為Z31J6L2067，HPLC含量≥98%）、柚皮苷（H24N9Z75869，HPLC 含量≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司，甲醇為HPLC 級試劑，其余為分析純，試驗用水為蒸餾水。

主要儀器：UV-9600 紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器集團(tuán)有限公司），KQ300-DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TDL80-2B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器產(chǎn)），TP-520A 電子天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司），HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），ATY124 電子天平（SHMADZU），島津LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品溶液制備 稱取柑橘果皮樣品粉末0.5 g，加入20 mL 甲醇，在210 W 的功率下超聲提取30 min。過濾，收集濾液。濾渣再用同法提取一次。合并2 次濾液，用甲醇定容至50 mL。溶液以2 500 r/min 離心10 min。離心液置4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 UV 直接比色分析方法 （1）對照品溶液制備。精密稱取橙皮苷對照品5.4 mg，用甲醇溶解[12]，定容于50 mL 容量瓶中，得橙皮苷對照品儲備液，濃度為0.108 mg/mL。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。吸取橙皮苷對照品儲備液0.5、1、1.5、2 和2.5 mL 于10 mL 帶塞比色管中，用甲醇定容，搖勻。于282 nm 下測定吸光值。以橙皮苷濃度（mg/L）對吸光度A 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）樣品測定。精密量取樣品溶液0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。按上法測定吸光值，以橙皮苷為標(biāo)樣計算總黃酮含量。

1.2.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯 色 比 色 法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。吸取橙皮苷對照品儲備液0.5、1、1.5、2 和2.5 mL 于10 mL 帶塞比色管中，加入0.5 mol 5%NaNO2溶液，放置5 min。再加10%Al(NO3)3溶液0.5 mL，放置5 min。再加5%NaOH 試液2.5 mL，用去離子水定容至刻度線，搖勻，常溫下顯色15 min。于346 nm 下測定吸光值。以橙皮苷濃度（mg/L）對吸光度A 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品測定。精密吸取50 μL 各樣品溶液，置于10 mL 比色管中，按上法操作測定吸光值，以橙皮苷為標(biāo)樣計算總黃酮含量。

1.2.4 堿顯色比色法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。吸取橙皮苷對照品儲備液1、1.5、2、2.5 和3 mL 于10 mL 帶塞比色管中，加入0.5 mL 10%NaOH 溶液，用水稀釋至刻度線，在60℃下水浴顯色30 min，流水冷卻至室溫，搖勻。于360 nm 波長下測定吸光值。以橙皮苷濃度（mg/L）對吸光度A 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。（2）樣品測定。精密量取不同樣品溶液0.2 mL，置于10 mL 比色管中，按上法操作測定吸光值，以橙皮苷為標(biāo)樣計算總黃酮含量。

1.2.5 HPLC 法 （1）液相色譜條件：InertSustain-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為0.1% 磷酸/水溶液，流動相B 為乙腈；梯度洗脫條件為0～ 25.00 min 20% B，25.00～25.10 min 20%～100% B，25.10～ 27.00 min 100% B，27.00～27.10 min 20% B，27.10～ 32.00 min 20% B；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測波長283 nm；進(jìn)樣量10 μL。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。配制系列濃度的橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷混合對照樣品溶液，在色譜條件下測定，以濃度（mg/L）對峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）樣品測定。按上法操作測定峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算指標(biāo)成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同顯色方法測定柑橘果皮總黃酮的最大波長和線性方程

在200～900 nm 波長范圍內(nèi)對橙皮苷及樣品的甲醇溶液、堿顯色溶液、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色溶液進(jìn)行波長掃描，3 種方法的最大吸收波長分別為282、360 和346 nm。在最大吸收波長下，峰型對稱性及吻合性較好，適合進(jìn)行含量測定。

在282 nm 下直接比色測定時，橙皮苷的濃度在 5.4～21.6 mg/L 范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系， 線性回歸方程A1=0.015 3+0.031 39 C1（R2=0.999，n=5）。 堿顯色法在360 nm 波長下測定時，橙皮苷的濃度在 4.4～22.0 mg/L 范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系， 線性回歸方程A2=-0.006 8+0.013 86 C2（R2=0.999，n=5）。 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色在346 nm 波長下，橙皮苷的濃度在8.8～26.4 mg/L 范圍內(nèi)與其吸光值具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程A3=-0.064 5+0.049 93 C3（R2=0.995，n=5）。

2.2 不同顯色方法測定總黃酮含量的差異性

由表1 可知，顯色方法對柑橘果皮中總黃酮的分析結(jié)果有影響。這與柑橘果皮中的次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)有關(guān)。UV 直接比色法是在282 nm 波長下測定的吸光度，從分子結(jié)構(gòu)來看，很多酚酸類在此波長下都會有吸收峰。因此，UV 直接比色法實(shí)際上測定的是提取物中酚酸類化合物的含量。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定的原理是含有鄰位羥基（或羰基）結(jié)構(gòu)的物質(zhì)與Al3+形成配合物而顯色。因此，該方法實(shí)際上測定的是具有這種結(jié)構(gòu)的多酚或者黃酮化合物的含量。而堿顯色法測定的原理是利用二氫黃酮在堿性條件下轉(zhuǎn)化為查爾酮顯橙色，具有特殊的吸收波長。理論上來說，此法測定的是二氫黃酮的含量。但是，黃酮類化合物的分子中含有鄰二酚羥基或者3,4’-二羥基取代時，在堿液中不穩(wěn)定，易被氧化而顏色由黃變深紅色[23]，對查爾酮的含量測定產(chǎn)生影響，這是否是測定結(jié)果偏高的原因，還有待進(jìn)一步探討。總之，文獻(xiàn)中常用的比色法測定植物提取物中黃酮類化合物的含量時，均是相對比較的、一大類結(jié)構(gòu)相似化合物的總量。雖然不同方法測定總黃酮含量的結(jié)果存在差異，但是，3 種方法測定的結(jié)果均提示湖南柑橘果皮含有豐富的黃酮類化合物，具有綜合利用價值。

表1 柑橘果皮中總黃酮的含量

圖1 HPLC 色譜圖

2.3 影響柑橘果皮總黃酮含量的因素分析

柑橘的品種、產(chǎn)地、采摘時間均影響果皮中總黃酮的含量（表1）。首先，柑橘品種。同一產(chǎn)地（澧縣）的柑橘皮總黃酮含量明顯高于臍橙皮總黃酮的含量，柑橘早熟品種與遲熟品種的果皮總黃酮含量也存在差異（但與采摘時間有關(guān)）。第二，采摘時間。1 號樣品和5 號樣品為同一品種柑橘，1 號樣品于10 月中旬采摘，是早熟品種剛好成熟的時期，而5 號樣品于11月下旬采摘，這個時期對于早熟品種來講果實(shí)過于成熟了。1 號果皮的總黃酮含量明顯高于5 號樣品，表明果實(shí)在適宜采摘時期總黃酮含量較高，過晚采摘會降低果實(shí)總黃酮的含量。第三，果皮干燥方式。柑橘果皮60℃烘干樣品（2 號）的總黃酮含量明顯高于曬干樣品（1 號）。60℃干燥的時間短，而10 月中旬的太陽溫和，干燥時間長，可能引起黃酮化合物的氧化分解。但干燥方式對臍橙果皮中總黃酮的含量影響小于柑橘果皮，這可能與臍橙果皮和柑橘果皮所含的二次代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。

2.4 HPLC 法測定柑橘果皮中的橙皮苷含量

植物提取物一般為多種結(jié)構(gòu)與溶解性類似的混合物，HPLC 分析技術(shù)在混合物單一成分的定量分析中展現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。進(jìn)一步以橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷為對照樣品，通過HPLC 色譜條件的優(yōu)化，有效實(shí)現(xiàn)了柚皮苷與橙皮苷的基線分離，混合對照樣品及柑橘果皮提取物的HPLC 色譜圖如圖1 所示，圖1A中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的相對保留時間分別為17.362、19.460、23.331 min。

按1.2.5 的色譜條件，橙皮苷濃度在18.50～129.50 mg/L 范圍內(nèi)，積分面積（y）與濃度（x）具有良好線性關(guān)系，線性方程為y=20 140.2x-3 488.16（R2=0.999 9， n=5）。

如圖1B 和C 所示。湖南柑橘果皮樣品主要含有橙皮苷，不含新橙皮苷及柚皮苷。這與一些相關(guān)報道的國內(nèi)柑橘果皮中橙皮苷含量高的結(jié)果基本一致。

2.5 影響柑橘果皮橙皮苷含量的因素分析

如圖2 所示，柑橘果皮中橙皮苷的含量也明顯高于臍橙和南豐蜜橘皮，柑橘果皮中橙皮苷的含量最高可到果皮干重的7%左右；同時，柑橘果皮中橙皮苷的含量還因產(chǎn)地及采摘時間（如1 號樣品明顯高于5號樣品）而存在差異。

3 結(jié) 論

紫外-可見分光光度法的測定結(jié)果表明，湖南柑橘果皮含有豐富的黃酮類物質(zhì)。HPLC 分析結(jié)果表明，湖南柑橘果皮樣品不含柚皮苷和新橙皮苷，橙皮苷的含量最高可達(dá)到果皮干重的7%左右，是良好的橙皮苷資源。同時，柑橘果皮中總黃酮和橙皮苷的含量可能因品種、產(chǎn)地及采摘時間不同而存在差異。因此，柑橘果皮作為橙皮苷的資源利用時，需要對品種、產(chǎn)地及采摘時間進(jìn)行綜合考察，以獲得最好的橙皮苷原材料。

圖2 HPLC 法測定不同樣品的橙皮苷含量