不同分子生物學(xué)檢測流程對(duì)肺結(jié)核病檢出率及耐藥患者發(fā)現(xiàn)率的影響

宋紅煥， 李國莉， 邵 燕， 陳 誠， 竺麗梅， 李 燕

(江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009)

全球每年有數(shù)以百萬的人口罹患結(jié)核病[1]。結(jié)核病至今依舊位列全球十大死因之一，是單病種病死率最高的傳染病[2]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)最新結(jié)核病疫情報(bào)告[3]顯示： 2017年，全球范圍內(nèi)估算有1010萬(結(jié)核病新發(fā)病例，其中男性約580萬例，女性約320萬例，兒童約100萬例。當(dāng)前，結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，給公眾健康帶來重大危害。2017年，全球利福平耐藥患者新發(fā)56萬例，其中約80%是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)，近50%的耐多藥結(jié)核病例發(fā)生在印度、中國和俄羅斯[4]。我國2017年新發(fā)利福平耐藥(RR-TB)的肺結(jié)核約6萬例，其臨床治療成功率僅約40%[5]。據(jù)此可知，我國的結(jié)核病防控形勢依舊十分嚴(yán)峻，如何早期診斷并納入治療，在耐多藥結(jié)核病的防控中尤為重要[6]。本研究對(duì)江蘇省開展結(jié)核病分級(jí)診療和綜合防治服務(wù)模式后，江蘇省各設(shè)區(qū)市分別采用的兩種不同分子生物學(xué)快速耐藥檢測流程對(duì)利福平耐藥(RR)/耐多藥(MDR)患者發(fā)現(xiàn)的影響進(jìn)行分析總結(jié)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例資料來源中國結(jié)核病管理信息系統(tǒng)，江蘇省結(jié)核病登記數(shù)據(jù)。肺結(jié)核患者納入標(biāo)準(zhǔn)參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 288—2017)。

回顧性分析2015年1月1日—2018年12月31日江蘇省各設(shè)區(qū)市結(jié)核患者患者報(bào)告數(shù)、病原學(xué)陽性結(jié)核患者報(bào)告數(shù)、耐藥患者發(fā)現(xiàn)數(shù)、利福平單耐藥/耐多藥患者報(bào)告數(shù)等指標(biāo)；對(duì)采用兩種不同分子生物學(xué)耐藥檢測流程地區(qū)的各類患者發(fā)現(xiàn)情況、兩種不同分子生物學(xué)耐藥檢測流程的時(shí)間成本等對(duì)比分析。

1.2 兩種不同分子生物學(xué)耐藥檢測流程

根據(jù)江蘇省《結(jié)核病分級(jí)診療綜合防治服務(wù)模式實(shí)施方案》，在江蘇省各設(shè)區(qū)市及其所轄縣分別采用兩種不同分子生物學(xué)耐藥檢測流程。

1.2.1 流程1 在江蘇省南京市、無錫市、宿遷市、連云港市、淮安市、鹽城市、揚(yáng)州市、常州市和蘇州市采用。選取痰涂片鏡檢陰性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，采用恒溫PCR(LAMP)方法，開展分子生物學(xué)檢測。病原學(xué)陽性樣本藥物敏感性檢測： 痰涂片染色顯微鏡檢查陽性樣本、恒溫PCR方法檢測陽性樣本、痰培養(yǎng)陽性樣本，按照《可感染人類的高致病性病原微生物-菌(毒)種或樣本運(yùn)輸要求》，將標(biāo)本于1周內(nèi)運(yùn)送至市級(jí)耐多藥結(jié)核病診治定點(diǎn)醫(yī)院，市級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院于3日內(nèi)進(jìn)行微陣列芯片法(流程1A)或線性探針技術(shù)(流程1B)耐藥性檢測。

1.2.2 流程2 江蘇省南通市、徐州市、泰州市和鎮(zhèn)江市4個(gè)設(shè)區(qū)市采用。所有活動(dòng)性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本均開展Xpert MTB-RIF檢測。病原學(xué)陽性樣本(包括痰涂片染色顯微鏡檢查陰性而培養(yǎng)陽性樣本、Xpert MTB檢測陽性且利福平耐藥的樣本)按照《可感染人類的高致病性病原微生物-菌(毒)種或樣本運(yùn)輸要求》，將標(biāo)本于1周內(nèi)運(yùn)送至市級(jí)耐多藥結(jié)核病診治定點(diǎn)醫(yī)院，市級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院于3日內(nèi)進(jìn)行線性探針技術(shù)耐藥性檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用率描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和單因素方差分析，趨勢分析采用χ2趨勢檢驗(yàn)；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 江蘇省肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率比較

通過數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)，自2015年開始逐步推廣分子生物學(xué)檢測后，江蘇省病原學(xué)陽性肺結(jié)核病人所占比例有所上升。對(duì)比2015年，2018年江蘇省全省范圍內(nèi)所有市、縣分子檢測全部覆蓋后，肺結(jié)核患者中病原學(xué)陽性率有顯著提高，病原學(xué)陽性率從30.7%提高至51.5%，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2015與2018年的病原學(xué)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2071.02,P=0.000)，見表1。

表1 2015—2018年江蘇省肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率比較

2.2 分子生物學(xué)耐藥檢測流程組別

采用兩種不同分子生物學(xué)耐藥檢測流程的市、縣分布如下。江蘇省內(nèi)無錫市、常州市、蘇州市、連云港市、淮安市、鹽城市、揚(yáng)州市、宿遷市等8個(gè)設(shè)區(qū)市采用微陣列芯片法進(jìn)行耐藥性檢測(流程1A)，南京市采用線性探針技術(shù)進(jìn)行耐藥性檢測(流程1B)，其轄區(qū)內(nèi)的47個(gè)縣采用恒溫PCR方法方法檢測(流程1)；南通市、徐州市、泰州市和鎮(zhèn)江市4個(gè)設(shè)區(qū)市采用線性探針技術(shù)進(jìn)行耐藥性檢測(流程2)，其轄區(qū)內(nèi)的30個(gè)縣采用Xpert MTB-RIF方法檢測。

2.3 江蘇省耐藥肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)情況比較

2015—2018年，江蘇省的結(jié)核病耐藥患者患者報(bào)告數(shù)分別為： 289、358、375和512例。對(duì)比2015年，2018年的耐藥患者患者報(bào)告數(shù)明顯升高，其中RR報(bào)告患者患者數(shù)上升尤為顯著。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與2015年相比，2018年的耐藥患者報(bào)告數(shù)顯著增高(χ2=137.1，P=0.000)，見表2。

表2 2015—2018年江蘇省耐藥患者患者報(bào)告情況

2.4 兩種不同流程的地區(qū)單耐利福平/耐多藥患者發(fā)現(xiàn)情況

經(jīng)數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)，江蘇省全省在2015—2018年內(nèi)，采用“流程1”進(jìn)行耐藥篩查的無錫市、常州市、蘇州市、連云港市、淮安市、鹽城市、揚(yáng)州市、宿遷市及南京市9個(gè)設(shè)區(qū)市的報(bào)告單耐利福平/耐多藥患者占各年度結(jié)核病總?cè)藬?shù)的比率分別為1.10%、1.35%、1.57%和2.26%。采用“流程2”進(jìn)行耐藥篩查的南通市、徐州市、泰州市和鎮(zhèn)江市4個(gè)設(shè)區(qū)市的報(bào)告單耐利福平/耐多藥患者占各年度結(jié)核病總?cè)藬?shù)患者的比率分別為1.11%、1.23%、1.22%和2.06%；兩組間數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 不同流程的地區(qū)單耐利福平/耐多藥患者 占各年度肺結(jié)核總患者數(shù)比例Fig.1 Proportion of RR/MDR patients in total TB patients in different regions

2.5 兩種流程的時(shí)間成本分析

流程1地區(qū)采用恒溫PCR法檢測： 選取痰涂片染色顯微鏡檢查陰性患者的痰標(biāo)本，在縣級(jí)定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)完成恒溫PCR方法檢測： 等待涂陰診斷大約需要3～5d不等，標(biāo)準(zhǔn)操作耗時(shí)約4h，可獲得結(jié)核分枝桿菌分子檢測結(jié)果，1周內(nèi)將病原學(xué)陽性標(biāo)本運(yùn)送至市級(jí)耐藥肺結(jié)核病定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)，市級(jí)機(jī)構(gòu)于收到樣本3d內(nèi)完成利福平、異煙肼耐藥分子檢測，故此流程獲得耐多藥分子診斷結(jié)果總耗時(shí)大約2周。

流程2地區(qū)所有診斷為肺結(jié)核的患者均對(duì)其痰標(biāo)本進(jìn)行Xpert MTB-RIF檢測，此方法標(biāo)準(zhǔn)操作耗時(shí)約2.5h，可同時(shí)獲得利福平耐藥分子檢測結(jié)果。即流程2在縣級(jí)定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)完成結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)檢測同時(shí)完成利福平耐藥檢測，可在2.5h內(nèi)完成利福平耐藥篩查，獲得利福平耐藥結(jié)果，后將利福平耐藥患者轉(zhuǎn)入市級(jí)定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)治療并完成其他藥物的耐藥檢測。

3 討 論

近年來，江蘇省結(jié)核病報(bào)告患者數(shù)有穩(wěn)步下降的趨勢，但利福平耐藥/耐多藥患者報(bào)告數(shù)卻存在上升趨勢，給結(jié)核病防控工作帶來了新的挑戰(zhàn)，并已成為引起社會(huì)各界高度重視的公共衛(wèi)生問題[7-8]。如何早期發(fā)現(xiàn)耐藥患者，是目前結(jié)核病防控工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是目前研究的焦點(diǎn)[9-11]。研究結(jié)果證實(shí)，結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)耐藥性的主要機(jī)制是其基因組的基因突變，已證實(shí)利rpoB基因與福平耐藥相關(guān)，katG及inhA基因與異煙肼耐藥相關(guān)[12-13]。在結(jié)核桿菌耐藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)加傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)仍然是實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但固體培養(yǎng)基的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，通常需要2個(gè)月左右才能獲得結(jié)果，不能滿足臨床需要，易影響患者的早期規(guī)范治療，甚至出現(xiàn)因不能及時(shí)診斷耐多藥結(jié)核病，而導(dǎo)致疫情失控，增加了防控難度[14]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，有關(guān)耐藥結(jié)核病分子機(jī)制研究的不斷進(jìn)展，耐藥結(jié)核病的快速診斷技術(shù)已逐漸成熟。近年來，江蘇省的結(jié)核病發(fā)患者數(shù)有穩(wěn)步下降的趨勢，我省的結(jié)核病報(bào)告發(fā)病數(shù)據(jù)中，病原學(xué)陽性率始終較低。為此，江蘇省從2015年開始使用分子生物學(xué)方法檢測肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，并對(duì)其陽性標(biāo)本開展耐藥基因檢測。2015—2018年將分子生物學(xué)檢測方法在全省各市、縣推廣，于2018年實(shí)現(xiàn)了全省結(jié)核病定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)范圍內(nèi)結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因的分子生物學(xué)檢測100%覆蓋到轄區(qū)內(nèi)的所有市、縣級(jí)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)。

本研究所采用的分子生物學(xué)方法均依據(jù)WHO發(fā)布的《結(jié)核病防治指南》[15]中推薦方法。該指南中推薦采用恒溫PCR方法用于結(jié)核病患者分子生物學(xué)檢測，推薦Xpert MTB-RIF法用于結(jié)核病患者分子生物學(xué)快速檢測及利福平耐藥基因檢測，采用線性探針技術(shù)開展利福平及異煙肼耐藥篩查。本研究中采用的Xpert MTB-RIF法，線性探針技術(shù)法是指南推薦方法；恒溫PCR方法及微陣列芯片法是與其同理的我國自主研發(fā)的分子生物學(xué)檢測方法，其中恒溫PCR方法用于結(jié)核病患者分子生物學(xué)檢測，微陣列芯片法用于利福平及異煙肼耐藥性檢測。

本中心將轄區(qū)內(nèi)的13個(gè)設(shè)區(qū)市分為兩組，分別采用不同的分子生物學(xué)檢測流程，以比較不同流程對(duì)利福平耐藥/耐多藥患者發(fā)現(xiàn)的影響。流程1中9個(gè)市的47個(gè)縣均采用恒溫PCR技術(shù)用于結(jié)核病患者分子生物學(xué)檢測，該方法主要是利用特異性引物在恒溫聚合酶作用下特異性擴(kuò)增樣本中的結(jié)核分枝桿菌核酸片段，再通過檢測核酸染料的信號(hào)，來判斷樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌。該方法具有較高的靈敏度與特異度。結(jié)果陽性的樣本再送至市級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院完成耐藥檢測。流程2中4個(gè)市的30個(gè)縣均采用Xpert MTB-RIF技術(shù)用于結(jié)核病患者分子生物學(xué)檢測，實(shí)現(xiàn)了樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測多個(gè)環(huán)節(jié)的自動(dòng)化運(yùn)行，耗時(shí)約為2.5h，同時(shí)可完成利福平耐藥基因檢測，檢測陽性的患者轉(zhuǎn)至市級(jí)定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)就診。線性探針法和DNA微陣列芯片技術(shù)均基于已知耐藥基因突變位點(diǎn)，通過對(duì)兩種最常用的一線抗結(jié)核藥物： 利福平和異煙肼的rpoB，katG及inhA基因，進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測，可以在24h之內(nèi)對(duì)樣本中的結(jié)核桿菌耐藥情況進(jìn)行評(píng)估，從而為臨床制定，實(shí)施有針對(duì)性的個(gè)體化治療方案提供重要診斷依據(jù)和用藥指導(dǎo)。

本研究重點(diǎn)關(guān)注采用分子生物學(xué)檢測方法對(duì)病原學(xué)陽性患者發(fā)現(xiàn)率和耐藥患者風(fēng)險(xiǎn)率的影響，同時(shí)探討江蘇省內(nèi)采用的兩種不同分子生物學(xué)耐藥檢測流程對(duì)利福平耐藥/耐多藥患者發(fā)現(xiàn)的影響有無差異。本研究結(jié)果顯示，與2015年相比，2018年江蘇省耐藥患者報(bào)告數(shù)有顯著提高，分析認(rèn)為與省內(nèi)全面采用分子生物學(xué)檢測方法有關(guān)，與Zhao等[6]、Yu等[16]的報(bào)道相似。同時(shí)本研究證實(shí)，相比于采用WHO指南推薦的Xpert MTB和線性探針技術(shù)方法(流程2地區(qū))，采用我國自主研發(fā)的恒溫PCR方法及微陣列芯片法的流程1地區(qū)，在利福平耐藥/耐多藥患者發(fā)現(xiàn)數(shù)上沒有顯著差異，與Bates等[17]的報(bào)道結(jié)果相似。

采用兩種不同流程的地區(qū)2018年單耐利福平/耐多藥患者發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)率均顯著高于2015年；兩種流程相比，耐藥結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)率沒有顯著差異,分析認(rèn)為各地實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身需求選取適宜的方法及流程完善結(jié)核病分子生物學(xué)檢測及耐藥篩查。

在縣級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)采用的兩種結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)檢測方法中，恒溫PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作包括： 核酸提取、PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增結(jié)果判讀，其中核酸提取環(huán)節(jié)存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，建議在2級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

Xpert MTB-RIF技術(shù)一步法操作，基本實(shí)現(xiàn)了完全自動(dòng)化的閉管操作，所需生物安全要求級(jí)別與痰涂片操作類似，可以在一級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室開展。

此外，由于Xpert MTB-RIF在完成結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)檢測的同時(shí)，可以完成利福平耐藥基因的檢測，因此可以在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)利福平耐藥患者，對(duì)耐藥患者早期發(fā)現(xiàn)和早期治療有一定意義。線性探針可做異煙肼、利福平耐藥，微陣列芯片還可做二線耐藥，適合在市級(jí)耐藥結(jié)核病定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)開展。與恒溫PCR技術(shù)或Xpert MTB-RIF技術(shù)相結(jié)合，可滿足結(jié)核分枝桿菌及其藥物敏感性的快速篩查。但分子生物學(xué)技術(shù)均為基于基因序列的快速檢測方法，并不能取代傳統(tǒng)的結(jié)核桿菌培養(yǎng)和表型藥敏實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)有的各種實(shí)驗(yàn)室檢測方法均有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)室在建立實(shí)驗(yàn)室檢測流程時(shí)是應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況做出選擇。