IFN-γ調節(jié)間充質干細胞免疫應答的分子機制

王藝靜， 高文霞， 石凱燕， 施佳玉， 孫 毅,2

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院干細胞臨床轉化中心，上海 200065)

間充質干細胞(mesenchymal stem/stromal cells, MSCs)是成體干細胞的一種，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層[1]，可從骨髓[2]、脂肪組織[3]、臍帶[4]、羊水[5]等分離獲得。MSCs因具有免疫調節(jié)作用，在自身免疫性疾病、炎癥、腫瘤等疾病的治療領域發(fā)揮重要作用[6]。

目前，有不少研究致力于提高MSCs的免疫調節(jié)能力，從而優(yōu)化治療效果。其中，對MSCs進行預處理是一種較為簡單的方法。常見的預處理方法有炎癥因子預處理[7]和缺氧/低氧預處理[8]。但是關于炎癥因子預處理MSCs對其免疫調節(jié)能力的影響，尚存在諸多爭議。有研究表明，炎癥因子如IFN-γ預處理MSCs，可以增強其免疫抑制特性，減輕炎癥反應[9]。但也有研究顯示，IFN-γ和TNF-α聯合預處理的MSCs引起結腸炎小鼠模型疾病的惡化[10]。因此，闡明炎癥因子調節(jié)MSCs免疫應答的分子機制，有利于MSCs應用于炎癥性疾病的臨床治療。IFN-γ是一種常見的炎癥因子，可由多種類型的細胞產生，包括激活的T細胞、NK細胞、NKT細胞以及巨噬細胞，在先天和適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用[11-14]。本研究通過分析GEO數據庫中GSE77814芯片表達數據，旨在探究IFN-γ預處理對MSCs轉錄組的改變，同時比較了不同濃度IFN-γ預處理的區(qū)別，深入揭示了炎癥因子IFN-γ調節(jié)MSCs免疫應答的分子機制，為炎癥因子預處理對其免疫調節(jié)能力的影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 來源

從GEO數據庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE77814骨髓間充質干細胞的基因表達數據，實驗材料與實驗步驟參考文獻[15]。該芯片所用的平臺為GPL13497 Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2(Probe Name version)。選取其中9例對照組的數據分別與3例IFN-γ(6.5ng/mL，低濃度組)預處理48h、3例IFN-γ(65ng/mL，高濃度組)預處理48h的數據進行分析。

1.2 差異基因的獲取

使用GEO數據庫自帶的GEO2R(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)的R語言程序對數據進行分析，剔除未知基因及非編碼RNA。以錯誤發(fā)現率(false discovery rate, FDR)<0.05且|logFC|≥1為差異基因(differentially expressed genes, DEGs)篩選條件，對IFN-γ-H DEGs中上調和下調變化最大的前15位基因做熱圖。

1.3 差異基因的GO富集分析和KEGG富集分析

對IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs分別采用DAVID 6.8數據庫進行GO富集分析(Gene Ontology，http：∥geneontology.org/)，采用KEGG Mapper(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， https：∥www.kegg.jp/)進行KEGG信號通路富集分析。

1.4 Uniprot蛋白數據分析

利用Uniprot數據庫(https：∥www.uniprot.org/)對IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs中上調的基因所編碼的蛋白分別進行細胞亞定位的分析。

1.5 蛋白互作網絡分析

利用STRING數據庫(https：∥string-db.org/)對IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs中上調的基因分別構建蛋白相互作用網絡(protein-protein interaction network, PPI network)，置信度為0.4。將得到的PPI網絡圖導入Cytoscape 3.7.2軟件，利用cytoHubba插件計算度值(degree)，以此作為關鍵靶基因的篩選的標準。

1.6 GSEA富集分析

由于一代富集分析方法如GO富集分析和KEGG富集分析是對篩選后的差異基因進行分析，存在遺漏其他重要基因的弊端。因此，這里使用二代富集分析方法GSEA 4.0.3(Gene Set Enrichment Analysis)對mRNA表達譜數據進行KEGG信號通路富集分析，旨在提供更全面的分析結果。以MsigDB數據庫中獲得基因集c2.cp.kegg.v7.0.symbols作為參照基因集，設定富集基因集的范圍為15～500個基因，隨機組合重復次數設置為1000次，尋找預處理后差異顯著的基因及其富集的通路。

2 結 果

2.1 差異基因分析

以FDR<0.05且|logFC|≥1為差異基因篩選條件。IFN-γ低濃度組與未處理組相比，共篩選出152個差異基因，其中133個為上調基因，19個為下調基因。IFN-γ高濃度組與未處理組相比，共篩選出648個差異基因，其中431個為上調基因，217個為下調基因。可以看出，IFN-γ高濃度處理條件下產生的差異基因幾乎包含了低濃度處理條件下產生的差異基因，且高濃度處理產生的差異基因數目更多，各差異基因組別之間有重疊關系，見圖1、表1～3。該結果表明，IFN-γ的濃度對MSCs轉錄組的影響較大。此外，趨化因子(如CXCL9、CCL8)和經典的抑炎因子IDO-1在高濃度的IFN-γ處理下才出現較高的表達。圖2為高濃度組處理下上調和下調差異倍數最大的15個基因的熱圖。

圖1 差異基因的Circos圖Fig.1 The Circos plot of DEGsCircos圖中，紫色的線連接相同的基因，藍色的線連接富集于相同本體條目的基因；該圖在Metascape平臺(http：∥www.metascape.org/)繪制完成

2.2 GO富集分析結果

IFN-γ-L DEGs的分析結果顯示，這些基因共參與105種生物學過程、35種細胞組分和32種分子功能。其中，FDR<0.01的生物學過程有20種、細胞組分有12種、分子功能有3種。絕大多數影響的生物學過程都與免疫相關，“免疫反應”富集的基因數目最多(n=34,FDR為3.14×10-20)；“IFN-γ介導的信號通路”最為顯著(n=30,FDR為1.94×10-41)。這些基因影響了多種細胞組分，主要集中于細胞生物膜系統(tǒng)。顯著影響的分子功能只有3個條目： 肽抗原結合、MHC Ⅱ類分子受體活性和抗原肽轉運蛋白1(transporter associated with antigen processing 1, TAP 1)結合。IFN-γ-H DEGs的分析結果顯示，這些基因共參與177種生物學過程、43種細胞組分和49種分子功能。其中，FDR<0.01的生物學過程有19種、細胞組分有7種、分子功能有2種。富集的條目與IFN-γ-H DEGs的富集結果接近。圖3列出了對生物學過程、細胞組分和分子功能影響最顯著的前10項GO條目(若有)。

表1 IFN-γ-L DEGs上調表達差異倍數最大的前10個基因

表2 IFN-γ-L DEGs下調表達差異倍數最大的10個基因

表3 IFN-γ-H DEGs上調表達差異倍數最大的10個基因

表4 IFN-γ-H DEGs下調表達差異倍數最大的10個基因

圖2 IFN-γ高濃度組上調和下調表達差異倍數最大的前15名基因熱圖Fig.2 Top 15 up-regulated and down-regulated gene expression of IFN-γ (high concentration) heat map

圖3 差異基因的GO富集分析Fig.3 GO analysis for DEGsA： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs；藍色代表生物學過程，綠色代表細胞組分，紅色代表分子功能

2.3 KEGG富集分析結果

分析結果顯示，IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs主要參與免疫、感染相關的信號通路，如單純皰疹病毒Ⅰ型感染、EB病毒感染、抗原處理與遞呈、流感病毒A等。此外，IFN-γ-H DEGs的富集結果中出現了代謝通路，且是富集數目最多的。

圖4 差異基因的KEGG富集分析Fig.4 KEGG analysis for DEGsA： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs

圖5 上調差異基因表達蛋白的分布情況(前5位)Fig.5 Proteins classified by cellular components (top 5)A： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs

2.4 Uniprot分析結果

對上調差異基因利用Uniprot數據庫進行細胞亞定位分析。IFN-γ-L DEGs的133個上調基因中，132個有蛋白注釋。IFN-γ-H DEGs的431個上調基因中，427個有蛋白注釋。這些蛋白絕大多數屬于生物膜系統(tǒng)，與2.2利用DAVID數據庫進行GO細胞組分富集分析的結果相一致。由于MSCs行使免疫調節(jié)功能與旁分泌作用密切相關，本研究對差異基因所編碼的分泌型蛋白進一步分析。低濃度處理條件下產生的分泌型蛋白對應的基因表達差異最大的前5位為TNFSF13B、OAS1、SECTM1、TNFSF10、IL18BP；而高濃度處理條件下的前5位為CXCL9、GBP1、CCL8、SCTM1、OAS1。

2.5 PPI網絡分析結果

圖6和圖7分別為IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs中上調表達的差異基因所構建的PPI網絡圖。圖8揭示了兩組分別篩選得到的前10位hub基因(顏色越偏向紅色代表該靶蛋白的度值越大)。

圖6 上調基因的PPI網絡圖(IFN-γ-L DEGs)Fig.6 PPI network of up-regulated IFN-γ-L DEGs

圖7 上調基因的PPI網絡圖(IFN-γ-H DEGs)Fig.7 PPI network of up-regulated IFN-γ-H DEGs

圖8 關鍵靶基因圖Fig.8 PPI network of hub genesA： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs

2.6 GSEA富集分析結果

以FDR<25%且標準化的P<0.05的基因集為陽性基因集，炎癥因子預處理后富集最顯著的前10項結果見表5～6。高濃度預處理組和低濃度預處理組富集最顯著的KEGG信號通路都是自身免疫性甲狀腺疾病，見圖9。

表5 IFN-γ低濃度預處理后富集的KEGG 信號通路及相關數據

表6 IFN-γ高濃度預處理后富集的KEGG 信號通路及相關數據

圖9 自身甲狀腺疾病的富集分析結果及相關基因集(IFN-γ低濃度處理)Fig.9 GSEA analysis for autoimmune thyroid disease and positively enriched associated molecules(low concentration of IFN-γ treatment)

3 討 論

本研究從GEO數據庫下載得到骨髓間充質干細胞經炎癥因子IFN-γ處理(6.5ng/mL，48h；65ng/mL，48h)和未處理組的芯片數據，利用GEO2R對數據進行分析。以FDR<0.05且|logFC|≥1為差異基因篩選條件，后續(xù)對編碼已知mRNA的差異基因進行分析。數據原作者Jin等[15]主要關注IFN-γ和TNF-α聯合預處理對MSCs轉錄組水平的影響，并未深入分析IFN-γ預處理對MSCs的影響。雖然作者指出IFN-γ和TNF-α具有協(xié)同作用，但有研究表明，IFN-γ對MSCs免疫應答的影響占據主要部分[16]，因此有必要深入闡明IFN-γ所發(fā)揮的作用。此外，原作者將不同濃度的炎癥因子預處理的轉錄組測序結果混合分析。盡管相比于不同種類的炎癥因子刺激，炎癥因子的濃度差異影響較小，但仍不可忽略。目前，關于IFN-γ的預處理濃度與MSCs免疫調節(jié)能力之間的關系較少，且背后分子機制的研究仍處于空白。因此，本研究從轉錄組水平揭示了不同濃度的IFN-γ預處理對MSCs基因表達水平的影響，以期為炎癥因子預處理對MSCs影響的研究進行補充。

本研究中，IFN-γ低濃度組與未處理組相比，共篩選出152個差異基因，其中133個為上調基因，19個為下調基因。IFN-γ高濃度組與未處理組相比，共篩選出648個差異基因，其中431個為上調基因，217個為下調基因。該結果表明，炎癥因子對間充質干細胞的轉錄組具有較大影響且機制復雜，并且與炎癥因子處理濃度有密切關系。

IFN-γ-L DEGs中，上調表達差異最大的基因主要和免疫相關，如MHC I類和MHC Ⅱ類相關分子、白介素相關基因。其中，有些基因會促進炎癥反應，如CD74和GBP5。CD74是巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migra-tion inhibitory factor, MIF)的特異性受體，與MIF結合后，可以激活細胞內的信號轉導系統(tǒng)，如p38MAPK，促進炎癥因子的釋放[17]。GBP5可以促進炎性小體的組裝和活化，促進炎癥的發(fā)生[18]。IFN-γ高濃度預處理使趨化因子和抑炎因子的表達量大大提升。在炎癥因子的刺激下，細胞的信號通路會產生變化。KEGG富集的結果顯示，無論是低濃度組還是高濃度組，IFN-γ都主要影響和免疫、抗感染等相關的通路。而對IFN-γ-H DEGs的富集分析結果顯示，代謝通路富集到的基因數目最多，提示高濃度的IFN-γ預處理可能對MSCs代謝產生較大的影響。有研究表明，IFN-γ預處理MSCs能使其代謝方式從原來的線粒體呼吸(mitochondrial respiration)轉化為有氧糖酵解(aerobic glycolysis)。這種代謝方式的轉換使得MSCs的代謝能力增強，提升了其促炎因子如PGE2的釋放水平，從而轉化為免疫抑制表型[19]。以血清剝奪的方式預處理48h，MSCs的能量代謝也會從氧化磷酸化為主轉變?yōu)樘墙徒鉃橹?，并上調糖異生相關的酶的表達。這種代謝方式的轉變有助于移植的MSCs在惡劣微環(huán)境中的存活，并能提高其免疫抑制能力[20]。因此，炎癥因子對MSCs細胞代謝的影響，以及MSCs細胞代謝與免疫調節(jié)功能之間的關系，有待進一步闡明。

MSCs的免疫調節(jié)能力受微環(huán)境影響很大[21]。盡管不少體外研究證實了MSCs具有良好的免疫抑制作用，但體內研究的結果并不十分明朗，可能與體內微環(huán)境不同有關。體內微環(huán)境的炎癥因子水平在不同疾病及不同個體中往往不盡相同。2014年，Wang等[22]提出MSCs的免疫調節(jié)具有可塑性的觀點，其能根據微環(huán)境的變化轉化為促炎型MSCs或抑炎型MSCs。在急性炎癥期時，高濃度的炎癥因子會刺激MSCs釋放大量抑炎因子如IDO-1和趨化因子，從而抑制炎癥反應。而在有低水平的炎癥因子暴露下，MSCs則表現出促炎的表型[23]。本研究的分析結果也與其相符。此外，炎癥因子刺激時間也會影響MSCs的免疫應答。MSCs在IFN-γ刺激后短時間內，會大量上調表達MHC分子，導致免疫原性升高，容易產生異體排斥。但隨著刺激時間增加，MSCs能夠自主下調表面MHC分子表達，降低免疫原性[24]。近年來，MSCs分泌的胞外囊泡(MSC-EVs)引起很大關注。胞外囊泡攜帶親本細胞來源的生物活性分子及基因調控信息，能通過與細胞直接接觸或被細胞內吞后釋放效應分子而影響受體細胞的功能，實現細胞間通訊[25]。已有不少文獻報道，MSCs分泌的胞外囊泡能影響多種免疫細胞，在修復組織損傷、抑制局部炎癥和調節(jié)免疫中發(fā)揮重要作用[26-28]。由于其為生物活性物質而非活體細胞，因此可控性較強，容易制訂生產管理方案，療效也較穩(wěn)定，避免了MSCs存在的受微環(huán)境影響而展現出免疫調節(jié)可塑性的問題，有望代替MSCs發(fā)揮生物學功能。

綜上，炎癥因子預處理對MSCs的免疫應答能夠產生深遠影響，因此要全面考慮炎癥因子種類、濃度、處理時間等不同所產生的差異。