18β-甘草次酸新衍生物對HaCaT細(xì)胞增殖的影響

羅麗梅 李 創(chuàng) 丁 銳 胥秀英 鄭一敏

1重慶化工職業(yè)學(xué)院制藥工程學(xué)院，重慶，401120；2重慶大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，重慶，400030；3 重慶理工大學(xué)，重慶，400054

甘草次酸(GA)是豆科植物甘草的有效成分之一，有抗炎、抗過敏、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[1]，臨床上也用于銀屑病治療[2]。18β-3-O-(5-甲基吡嗪-2-甲酰)-甘草次酸(GA2)是甘草次酸新衍生物，與甘草次酸相比有更好的油水分配性。銀屑病(psoriasis)，是一種以真皮慢性炎癥與表皮過度增生為特征的自身免疫性皮膚病[1]，有“不死的癌癥”之稱[2]，病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)的過度增殖和炎癥細(xì)胞浸潤，嚴(yán)重影響患者的身心健康[3，4]。HaCaT細(xì)胞是自發(fā)永生化的人角化細(xì)胞系，已廣泛用于銀屑病的研究[5]。本文開展了GA2對HaCaT細(xì)胞增殖抑制作用和誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的體外研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HaCaT細(xì)胞(購自美國ATCC庫)，GA2(由實(shí)驗(yàn)室合成，純度≥99%，有關(guān)結(jié)構(gòu)及確證另文發(fā)表)，DMEM(美國Hyclone公司)，CCK8(日本同仁化學(xué)研究所)，EdU、Annexin V-FITC試劑盒、免疫染色固定液、Caspase 3活性檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，結(jié)晶紫(成都市克隆化工試劑廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)將HaCaT細(xì)胞接種于含10%胎牛血清，100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%的CO2孵箱培養(yǎng)[6]。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測 采用0～150 μM GA2分別處理HaCaT細(xì)胞24 h，根據(jù)抑制率計算IC50選擇31.2、62.5、125 μM GA2分別作為后續(xù)試驗(yàn)藥物作用濃度。采用CCK-8、EdU法[7，8]檢測GA2對處于對數(shù)生長的HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用。以5×104/mL接種于96孔板，每孔90 μL，24 h棄培養(yǎng)基分別加入含31.2、62.5、125 μΜ的GA2培養(yǎng)基，復(fù)3孔，同時設(shè)置125 μΜ的陽性藥維A酸(Retinoid acid)組、125 μΜ的原料藥GA組和Control空白對照組。

1.2.3 細(xì)胞克隆 將HaCaT細(xì)胞接種于6孔板并培養(yǎng)過夜。GA2作用24 h后棄去舊培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基并培養(yǎng)2周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)用含4%多聚甲醛的免疫染色固定液固定，結(jié)晶紫染色。數(shù)碼相機(jī)拍照，計數(shù)大于50個細(xì)胞組成的菌落。集落形成率=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%[9]。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡 HaCaT細(xì)胞經(jīng)GA2作用24 h后，用不含EDTA的胰酶消化，離心收集細(xì)胞，分別向各組細(xì)胞中加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL PI碘化丙啶染色液進(jìn)行染色，將樣品過濾然后轉(zhuǎn)移至流式管，用流式細(xì)胞儀CellQuest software對樣品進(jìn)行檢測分析[10]。

1.2.5 Caspase 3活力測定 GA2作用HaCaT細(xì)胞24 h后，用胰酶消化，冰浴裂解15 min后，取少量樣品用于蛋白測定和酶活性檢測。根據(jù)檢測Caspase 3酶活性所用蛋白量，計算出單位重量蛋白中所含的Caspase 3的酶活力。

2 結(jié)果

2.1 GA2對HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用 31.2、62.5、125 μM GA2作用HaCaT細(xì)胞24 h后，隨著濃度的增大，抑制率逐漸增大(圖1)，單位面積細(xì)胞數(shù)量逐漸變少，細(xì)胞變圓、變小且邊緣清晰(圖2)。EdU可以染色處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，Hoechst33342能夠?qū)⑺谢罴?xì)胞進(jìn)行染色，通過EdU和Hoechst33342染色后HaCaT細(xì)胞EdU染色陽性率隨濃度增大顯著降低，可見，GA2有增殖抑制作用，且具有劑量依賴性(圖3)。

2.2 GA2對HaCaT細(xì)胞克隆形成的影響 經(jīng)31.2、62.5、125 μM GA2作用24 h后，HaCaT細(xì)胞的克隆數(shù)較Control組顯著減少,且呈濃度依賴性。GA2能夠顯著抑制HaCaT細(xì)胞的克隆形成能力(圖4)，進(jìn)而抑制HaCaT細(xì)胞的增殖。

2.3 GA2對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 與Control組相比，31.2、62.5、125 μM的GA2均可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生凋亡。中、高劑量和Control組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中高劑量組誘導(dǎo)凋亡作用最為顯著(圖5)。

2.4 GA2對Caspase3活性變化的影響 Caspase 3是細(xì)胞凋亡過程中的效應(yīng)性蛋白裂解酶，引起細(xì)胞凋亡。在GA2作用HaCaT細(xì)胞的過程中，Caspase 3的活性隨著GA2(31.2、62.5、125 μM)濃度的變化，具有逐漸增高的趨勢(圖6)，統(tǒng)計處理顯示經(jīng)GA2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞與Control組的Caspase 3的活性均存在顯著差異，提示Caspase 3參與GA2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的凋亡。

圖5 藥物對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響(**,P<0.01;***,P<0.001) 圖6 藥物對HaCaT細(xì)胞Caspase 3活性的影響(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)

3 討論

GA屬于五環(huán)三萜類化合物，有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，但其溶解性差，油水分配性不好。目前，卡泊三醇、維A酸類及金屬蛋白酶抑制劑等銀屑病藥物均在抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡上發(fā)揮作用[11,12]，但它們有局部刺激、光敏和致畸等不良反應(yīng)，因此尋找安全、有效、穩(wěn)定、可控的銀屑病藥物已是當(dāng)務(wù)之急。GA2是對GA進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的新衍生物，溶解性大于GA。角質(zhì)形成細(xì)胞的高速增殖與分化是導(dǎo)致銀屑病的原因之一。本研究以HaCaT細(xì)胞為靶細(xì)胞，從細(xì)胞增殖和凋亡方面對GA2作用HaCaT細(xì)胞的機(jī)理做了初步探討。

研究表明，GA2呈濃度依賴性抑制HaCaT增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且強(qiáng)于原料藥GA，與解凡等[13]發(fā)現(xiàn)GA可抑制HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果相吻合。目前，尚無人通過EdU、細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)研究GA對HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用。張麗宏等[14]發(fā)現(xiàn)甘草酸能抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2有關(guān)。王俊慧等[15]發(fā)現(xiàn)五環(huán)三萜類化合物熊果酸可將HaCaT細(xì)胞阻滯于G1/G0期，同時可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡。本文發(fā)現(xiàn)，31.2 μM GA2能夠抑制HaCaT細(xì)胞增殖并通過上調(diào)Caspase 3表達(dá)誘導(dǎo)其凋亡，隨著濃度，現(xiàn)象愈加明顯。提示GA2 對HaCaT細(xì)胞增殖有抑制作用，通過促進(jìn)Caspase 3的表達(dá)促進(jìn)其凋亡，但是否有其他誘導(dǎo)其凋亡的途徑值得深入研究。

炎癥因子的過度表達(dá)是導(dǎo)致銀屑病發(fā)病的另一原因?？禒栤16]等人發(fā)現(xiàn)KGF能夠顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖; 不同劑量甘草黃酮處理后可顯著上調(diào)HaCaT的IL-10的表達(dá)[17]。下一步課題組將研究GA2對HaCaT炎癥因子的表達(dá)情況并采用多種方法對試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，評價GA2的安全性，構(gòu)建銀屑病樣模型，進(jìn)行體內(nèi)研究。