卵巢組織冷凍保存策略的探討

鄭春楊，程?hào)|凱，于洪君，李寶山，劉雙

（沈陽(yáng)東方菁華醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

0 引言

在一些國(guó)家，卵巢組織冷凍保存(OTC)已經(jīng)在臨床環(huán)境中進(jìn)行了20多年，目的是挽救面臨非自然加速卵泡喪失的患者的生育能力。據(jù)估計(jì)，目前全世界有超過(guò)1萬(wàn)名女童和婦女接受了OTC治療[1,2]。手術(shù)過(guò)程包括切除卵巢組織，然后冷凍皮質(zhì)組織，使其厚度約為1毫米。冷凍需要使用冷凍保護(hù)劑，以避免冰晶的形成和破壞細(xì)胞的完整性。目前有幾種冷凍介質(zhì)和方案，卵巢皮質(zhì)組織冷凍，尤其是卵泡發(fā)育的早期階段似乎對(duì)冷凍有很強(qiáng)的抵抗力。該組織儲(chǔ)存在液氮中，經(jīng)過(guò)短期儲(chǔ)存和17年的冷凍后，卵泡的存活率也很好，這證明了該組織的長(zhǎng)期存活率。解凍后，組織可以移植到原來(lái)的婦女身上。由于皮質(zhì)組織主要包含卵泡發(fā)育的早期階段，組織需要3-6個(gè)月才能恢復(fù)全部活動(dòng)，包括維持排卵前卵泡的發(fā)育和釋放可受精的卵母細(xì)胞。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)從主要以動(dòng)物研究為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)性技術(shù)，發(fā)展成為一項(xiàng)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格驗(yàn)證的臨床冷凍技術(shù)。實(shí)驗(yàn)室調(diào)查和臨床實(shí)踐表明，幾乎所有婦女在組織移植后都能恢復(fù)卵巢功能[3,4]。由于顯而易見(jiàn)的原因，卵巢組織移植(OTT)的數(shù)量遠(yuǎn)低于被冷凍卵巢的數(shù)量:①患者需要時(shí)間從癌癥中恢復(fù)；②避免一段時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)；③一些患者是尚未打算生育的年輕女孩，她們的儲(chǔ)存期預(yù)計(jì)為10-20年甚至更長(zhǎng)；④一些婦女盡管接受了促性腺激素毒性治療，但仍能維持月經(jīng)周期，可能不需要冷凍保存組織來(lái)繁殖；⑤一些患者可能無(wú)法存活。

OTC被用于保存生殖腺毒性治療的惡性疾病或非惡性疾病患者的生育能力，例如全身性紅斑狼瘡，但患有罕見(jiàn)遺傳疾病的婦女也受益于OTC。癌癥疾病仍然是使用OTC的主要指征，但其他各種診斷也可能受益于此技術(shù)。

最近的一項(xiàng)研究評(píng)估了364名接受OTT治療的女性，發(fā)現(xiàn)95%以上的移植女性卵巢功能得到恢復(fù)或增強(qiáng)，表明冷凍過(guò)程本身不應(yīng)該再被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)性的[2]。組織的功能壽命是高度可變的，但取決于OTC時(shí)患者的年齡、凍結(jié)時(shí)卵巢儲(chǔ)備的大小和移植組織的數(shù)量。然而，值得注意的是，一些女性的卵巢功能持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(長(zhǎng)達(dá)10年)，而另一些女性的卵巢功能持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短，只有1-2年[4]。

目前，據(jù)估計(jì)，全世界有130多名兒童從OTT受孕[1,2,5]。因此，從冷凍/解凍的卵巢組織恢復(fù)生育能力確實(shí)是一個(gè)發(fā)展的領(lǐng)域，這無(wú)疑將見(jiàn)證許多進(jìn)步和新進(jìn)展。人們很容易聯(lián)想到試管嬰兒技術(shù)的引入。自上世紀(jì)70年代初至80年代中期出生的第100名試管嬰兒以來(lái)，出現(xiàn)了大量的新方法和新技術(shù)，盡管試管嬰兒技術(shù)在80年代初的臨床突破之前就已經(jīng)確立了。事實(shí)上，在第一個(gè)試管嬰兒出生后的幾十年里，試管嬰兒的成功率一直在上升。卵巢組織的冷凍具有相同的潛力。體外受精可能會(huì)成為一種廣泛使用的技術(shù)，主要是因?yàn)槁殉驳墓δ軉卧粌?chǔ)存，而不僅僅是卵母細(xì)胞，它可以恢復(fù)生育能力和內(nèi)分泌功能，為組織的新用途提供選擇。

1 卵巢組織冷凍的適應(yīng)癥

OTC的目的只有一個(gè):維持卵巢結(jié)構(gòu)和生理功能，適用于不同情況下的多靶點(diǎn)患者。OTC已被證明主要用于保護(hù)因使用促性腺激素治療而面臨卵巢功能不全和不孕風(fēng)險(xiǎn)的癌癥患者的生育能力[2]。此外，這是青春期前患者保留生育能力的唯一選擇，因?yàn)樵谶@些情況下，刺激卵巢和收集卵母細(xì)胞的方案是不可能的[1]。然而，良性疾病如復(fù)發(fā)性卵巢囊腫、卵巢扭轉(zhuǎn)、內(nèi)分泌紊亂和自身免疫性疾病的患者也可能受益于這項(xiàng)有前景的技術(shù)[6]。

OTC技術(shù)使全世界130多名健康嬰兒得以出生[1]。2017年進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析顯示，在進(jìn)行自體移植后，重建卵巢活性(63.9%)和自然活產(chǎn)(57.5%)的成功率很高[7]。

然而值得一提的是，由于受教育、職業(yè)規(guī)劃、經(jīng)濟(jì)不穩(wěn)定，甚至在尋找伴侶方面可能遇到的困難，越來(lái)越多的女性對(duì)推遲首次懷孕產(chǎn)生了興趣[8]。在過(guò)去的35年中，首次懷孕的平均年齡增加了2-4歲，現(xiàn)在已經(jīng)超過(guò)了30歲。由于隨著年齡的增長(zhǎng)，卵泡的質(zhì)量和數(shù)量都會(huì)顯著下降，冷凍儲(chǔ)存是改善妊娠結(jié)局的另一種選擇。

OTC也可用于延緩絕經(jīng)[9]。世界人口預(yù)期壽命的增加與更年期婦女人數(shù)的增加相結(jié)合。在一些歐洲國(guó)家，本世紀(jì)出生的大多數(shù)女孩可能會(huì)活到100歲以上，這意味著她們生命中的很大一部分將在絕經(jīng)后展開(kāi)[10]。與更年期相關(guān)的副作用(骨質(zhì)疏松、心血管疾病、性功能障礙、抑郁等)會(huì)對(duì)婦女的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生巨大影響，這可能會(huì)成為一個(gè)重大的經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。另一種延緩絕經(jīng)的選擇是藥物激素替代的處方。然而，藥物激素替代可能不適合某些婦女，包括心血管疾病、血栓栓塞性疾病或某些癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加的婦女。早期的非處方類藥物可以保護(hù)大量的卵泡，這些卵泡可能會(huì)在以后產(chǎn)生女性荷爾蒙，從而延緩更年期的到來(lái)。為了避免妊娠風(fēng)險(xiǎn)和降低卵巢組織再植的成本，解凍后的卵巢組織碎片可以異位移植。

2 如何冷凍保存人類卵巢組織

2.1 常規(guī)冷凍方法

慢速冷凍法是目前最常用的卵巢組織冷凍保存方法。本程序使用可編程的冷凍機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)控制的冷凍速度。在任何緩慢的冷凍過(guò)程中，冰晶首先在細(xì)胞/組織外形成。當(dāng)水凝固時(shí)，外界環(huán)境變得高滲。眾所周知，快速冷卻的速度會(huì)阻止細(xì)胞內(nèi)的水離開(kāi)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成，從而造成細(xì)胞損傷。另一方面，緩慢的冷卻速率允許滲透調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的液體，但它們可能導(dǎo)致過(guò)度脫水和收縮。

在低溫保存培養(yǎng)基中加入低溫保護(hù)劑(CPAs)有助于克服這些問(wèn)題。CPAs的作用是保護(hù)細(xì)胞不受冰晶和高滲性的傷害。然而，在凍融過(guò)程中，CPAs會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生滲透作用。當(dāng)細(xì)胞暴露于滲透的CPAs時(shí)，它們最初會(huì)經(jīng)歷脫水和收縮，然后當(dāng)CPAs進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，它們又恢復(fù)到原來(lái)的體積。這些體積的變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡，這取決于它們的速度和大小。添加CPAs也會(huì)引起化學(xué)毒性對(duì)細(xì)胞的損傷[11]。最佳暴露的目的應(yīng)是盡量減少滲透應(yīng)力，同時(shí)避免化學(xué)毒性，并允許充分的滲透和脫水，以實(shí)現(xiàn)對(duì)凍傷的保護(hù)。

CPAs分為兩類[12]:

（1）滲透劑:甘油，二甲基亞砜DMSO，乙二醇和1,2-丙二醇(PROH);它們的分子量較低，可以通過(guò)細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層，盡管它們的速度比水慢。

（2）非滲透劑:糖(蔗糖、海藻糖和棉子糖)和大分子(Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮)，以及蛋白質(zhì)和脂蛋白;它們?nèi)匀淮嬖谟诩?xì)胞外溶液中，因?yàn)樗鼈兪谴蠓肿?，有助于促進(jìn)有控制的細(xì)胞脫水。

在大多數(shù)卵巢組織的慢速冷凍方案中，使用一種滲透劑和一種非滲透劑的組合。CPA濃度在滲透劑(通常為DMSO)為1.5 M，在非滲透劑(通常為蔗糖)的濃度為0.1 M。

2.2 玻璃化冷凍技術(shù)

最近，人類卵巢組織也通過(guò)玻璃化冷凍保存[13,14]。玻璃化是將過(guò)冷的液體轉(zhuǎn)化成玻璃狀的無(wú)定形固體，防止冰晶形成的過(guò)程。玻璃化過(guò)程是基于超快的冷卻速度和高濃度CPAs[15]。然而，高濃度的CPAs對(duì)細(xì)胞有毒性作用。正因?yàn)槿绱?，玻璃化方法通常使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的CPAs的組合，因此，他們的濃度總和支持玻璃化，而每個(gè)低濃度的CPA則降低了其毒性作用[16]。理論上，任何滲透的CPA都可以用于玻璃化。然而，乙二醇正被確立為最佳選擇，因?yàn)樗牡投拘院涂焖贁U(kuò)散到細(xì)胞[17,18]。影響玻璃化的另一個(gè)因素是樣品的體積。樣品越小，需要冷卻的液體越少，形成冰晶的概率越低。為了實(shí)現(xiàn)液體的低體積，使用了不同的冷凍方法，如介質(zhì)液滴，固體表面，銀封閉玻璃化系統(tǒng)，塑料吸管[19]。玻璃化冷凍是一種快速、簡(jiǎn)便的方法，不需要特別昂貴的設(shè)備。雖然這看起來(lái)很簡(jiǎn)單，但如果冷卻速度不夠快，結(jié)晶可能會(huì)發(fā)生。在成功的玻璃化過(guò)程中，組織和周圍的溶液變得透明，而失敗的玻璃化過(guò)程則以不透明的白色樣品為特征，這意味著冰晶已經(jīng)形成。

盡管這種保存方法越來(lái)越受歡迎，但仍很少用于卵巢組織保存。與緩慢冷凍不同，卵巢組織沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的玻璃化程序。除了日本研究小組報(bào)道的2例嬰兒外，Kiseleva等人也報(bào)道了使用玻璃化卵巢組織的良好結(jié)果[13,14,20]。在他們的病例研究中，玻璃化卵巢組織在自體移植后表現(xiàn)出生殖潛能的恢復(fù)。

2.3 解凍/升溫和再結(jié)晶的風(fēng)險(xiǎn)

對(duì)于緩慢凍結(jié)或玻璃化的組織，在變暖過(guò)程中形成冰的風(fēng)險(xiǎn)是一個(gè)需要考慮的重要因素。變冷和變暖的速率相互作用，如果仔細(xì)考慮兩者，就能找到一個(gè)合適的結(jié)果。脫氮作用是將超濃水轉(zhuǎn)化為結(jié)晶冰的過(guò)程。再結(jié)晶發(fā)生在降溫過(guò)程中形成的小冰晶在升溫過(guò)程中生長(zhǎng);結(jié)果，在先前清晰的樣本中出現(xiàn)了不透明的外觀[21]。玻璃化體系再結(jié)晶的風(fēng)險(xiǎn)更大，因?yàn)樯郎剡^(guò)程比冷卻速率的作用更大[22]。在玻璃化過(guò)程中，水應(yīng)直接從液體變成玻璃。然而，在變暖期間，有可能形成冰晶而不是“冰泥”，通過(guò)將玻璃轉(zhuǎn)化為一種高粘度的過(guò)冷液體。玻璃化體系的升溫過(guò)程分三個(gè)階段:從玻璃化到超濃化、脫氮(將水轉(zhuǎn)變?yōu)楸?和再結(jié)晶(生長(zhǎng)非常小的冰晶)[21]。玻璃化過(guò)程中小冰核的形成是不可避免的。然而，如果在升溫過(guò)程中有足夠的時(shí)間，就會(huì)發(fā)生更多的成核和晶體生長(zhǎng)，導(dǎo)致組織的形態(tài)損傷[23]。為了避免這種情況，必須提高升溫速率，并確保適當(dāng)?shù)腃PA濃度。

一旦樣品被加熱/解凍，注意CPA的去除。在這個(gè)步驟中，滲透不平衡可能由于細(xì)胞吸收水分而發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹。在玻璃化組織中情況更糟，組織碎片中存在高濃度的CPA。為了避免或最小化這個(gè)問(wèn)題，CPA去除可以緩慢進(jìn)行。為此，可使用蛋白(人血清白蛋白或血清代用品)或糖(葡萄糖或蔗糖)等溶質(zhì)，控制CPA的去除。通常，在去除CPA的過(guò)程中會(huì)使用含有較低CPA濃度的混合溶液。

2.4 OTC的未來(lái)趨勢(shì)

盡管冷凍保存的卵巢組織移植獲得了成功的結(jié)果，但研究表明冷凍對(duì)卵巢基質(zhì)組織有負(fù)面影響，顆粒細(xì)胞，膜細(xì)胞形成可能參與了大量的空卵泡的形成，這些空卵泡存在于移植的冷凍化的卵巢組織中，影響卵巢組織的功能[24]。這些發(fā)現(xiàn)可能是由于冰晶的形成，這是冷凍過(guò)程中固有的步驟，也是傷害和細(xì)胞死亡的主要來(lái)源。為了優(yōu)化人卵巢組織的冷凍方案，使CPA在卵巢組織樣本內(nèi)分布更加均勻，Corral等人決定對(duì)目前慢冷凍過(guò)程中的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行修改[25]。他們更好地證明了這一點(diǎn)DMSO濃度越高，CPA在牛卵巢組織中的通透性和均勻性越好。該方案隨后在人類卵巢組織上進(jìn)行了測(cè)試，在20% DMSO濃度的冷凍樣品中，由于DMSO濃度較高，形成冰的可能性較小。在短期異種移植后，組織碎片內(nèi)的CPA含量并沒(méi)有提高卵巢組織的存活率[26]。盡管如此，較長(zhǎng)時(shí)間的異種移植最終可能會(huì)從這種優(yōu)化的方案中獲益。

幾年前，人們對(duì)卵巢組織進(jìn)行了定向冷凍[27]。這一策略允許在不同大小的樣品中精確而均勻的冷卻速率，這是通過(guò)一個(gè)熱力學(xué)原理實(shí)現(xiàn)的，在這個(gè)熱力學(xué)原理中，冰晶通過(guò)預(yù)先設(shè)定的溫度梯度來(lái)控制整個(gè)樣品的移動(dòng)速率[28]。這樣，當(dāng)冰晶在與樣品運(yùn)動(dòng)相反的方向生長(zhǎng)時(shí)，組織樣品正在冷卻。該方法成功地實(shí)現(xiàn)了全羊卵巢的冷凍保存。盡管有這些有希望的發(fā)現(xiàn)，定向冷凍尚未在人類卵巢組織上進(jìn)行測(cè)試。

如前所述，玻璃化已被認(rèn)為是一種替代慢速冷凍的方法，因?yàn)樗驯蛔C明可以保存基質(zhì)組織的超微結(jié)構(gòu)[29]。然而，玻璃化是基于三個(gè)關(guān)鍵步驟:添加高CPA濃度和實(shí)現(xiàn)高冷卻和升溫率來(lái)降低CPA毒性。為了避免CPA的毒性作用，Corral等人開(kāi)發(fā)了一種名為“分級(jí)玻璃化”的程序，即在CPA升高的同時(shí)逐步降低溫度[30]。它們的策略與平衡玻璃化的不同之處在于CPA毒性隨溫度的下降和體系熔點(diǎn)的降低不需要遵循相同的曲線。

Manuchehrabadi等人還開(kāi)發(fā)了新的方法來(lái)改善低溫保存組織的解凍/升溫過(guò)程，稱之為納米升溫技術(shù)[31]。納米顆粒可以懸浮在玻璃化或冷凍溶液中，用于在低溫貯藏樣品中誘導(dǎo)均勻的升溫。這一策略依賴于激光波推動(dòng)的納米粒子振蕩的概念，激光波在整個(gè)樣品中產(chǎn)生熱耗散，使溫度均勻。

3 總結(jié)

OTC已越來(lái)越多地應(yīng)用于癌癥患者和良性腫瘤婦女的生育能力保護(hù)，近年來(lái)被認(rèn)為是健康婦女延緩妊娠和絕經(jīng)的一種策略。雖然在慢速冷凍過(guò)程中有更可靠的結(jié)果，世界各地的中心已經(jīng)開(kāi)始測(cè)試玻璃化方案。盡管如此，優(yōu)化冷凍保存策略和解凍/升溫方案對(duì)于提高冷凍保存的卵巢組織中卵泡的存活率是必要的。