miR15b對(duì)K562/a02細(xì)胞增殖凋亡及耐藥性的影響

張夢(mèng)涵，薄海美，劉牧

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

0 引言

近20年來，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，一系列與白血病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的基因、受體、細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵物質(zhì)等相繼被發(fā)現(xiàn)，使得分子水平的靶向治療以及以這些靶向?yàn)槟繕?biāo)的新型藥物的研發(fā)日益成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)在我們的醫(yī)療行業(yè)更加注重循證醫(yī)學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)，而不是過去的經(jīng)驗(yàn)主義，只有這樣我們才能更好的把握疾病的病因及其可能發(fā)展的走向。DNA/RNA基因、蛋白、生物體，一步步影響著疾病的發(fā)展。本綜述內(nèi)容涉及K562/a02細(xì)胞的耐藥機(jī)制，為臨床減少治療白血病耐藥性提供靶向幫助及耐藥機(jī)制的參考。為臨床白血病的治療帶來希望，減少白血病的耐藥及復(fù)燃，減輕病人的經(jīng)濟(jì)、家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)。

1 K562/a02細(xì)胞增殖凋亡及耐藥性

1.1 K562/a02細(xì)胞與白血病的關(guān)系

K562細(xì)胞來自慢性髓性白血病患者的淋巴母細(xì)胞，也是第一個(gè)體外培養(yǎng)的人髓性白血病細(xì)胞系，在白血病發(fā)病機(jī)制研究、藥物靶標(biāo)和治療等方面具有廣泛的應(yīng)用和作用，有研究表明TGF-β可誘導(dǎo)K562細(xì)胞增殖[1]。而K562/A02是K562的耐藥株。李秀軍研究發(fā)現(xiàn)[2]抑制白血病耐藥細(xì)胞K562/a02增殖，并通過誘導(dǎo)K562/a02細(xì)胞的凋亡可發(fā)揮逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。

1.2 miRNA與K562/a02細(xì)胞關(guān)系

近年來，越來越多的研究證據(jù)表明，miRNA 基因的突變或miRNA 表達(dá)失調(diào)與多種人類癌相關(guān)，miRNAs能夠發(fā)揮促癌或抑癌功能，參與不同類型癌的發(fā)生發(fā)展[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)miR-150的K562細(xì)胞中，c-Myb的mRNA水平?jīng)]有明顯改變，蛋白水平則顯著下降，說明miR-150可以特異性抑制K562細(xì)胞內(nèi)c-Myb蛋白水平的表達(dá)，可以顯著抑制K562細(xì)胞的增殖，對(duì)K562細(xì)胞周期的運(yùn)行也具有明顯抑制作用[5]。孫玲研究[6]發(fā)現(xiàn)，miR-543可靶向Wnt蛋白，抑制Wnt信號(hào)通路活性，從而抑制K562細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞的凋亡。miR-132是目前比較公認(rèn)的抑癌性miRNA，轉(zhuǎn)染miR-132類似物后，K562細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡增加，其機(jī)制可能是通過激活SRIT1/P53凋亡通路，促進(jìn)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，擾亂細(xì)胞促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白之間的平衡，從而使細(xì)胞凋亡增加[7]。

1.3 ABCC5與K562/a02細(xì)胞關(guān)系

與白血病耐藥相關(guān)的ABCC亞家族成員中，ABCC1與ABCC2結(jié)構(gòu)功能很類似，具有轉(zhuǎn)運(yùn)GSH結(jié)合物的泵功能，與順鉑和阿霉素耐藥相關(guān)；ABCC2和ABCC3/MRP3與甲氨蝶呤耐藥相關(guān)；ABCC4/MRP4與6-巰嘌呤和巰鳥嘌呤耐藥有關(guān)；ABCC4在ALL中有表達(dá)，并且36%的ABCC5/NRP5與ABCC4有同源性，參與了ALL患者的巰嘌呤耐藥性[8]。在伊馬替尼耐藥株細(xì)胞系K562-R中證實(shí)，ABCA2可以抑制耐受伊馬替尼的化療效果，主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)Wnt和MEK等信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)[9]。重組腺病毒Ad-siABCG2沉默，ABCG2基因表達(dá)可增加K562細(xì)胞對(duì)ADM和DNR的敏感性，表明 ABCG2基因表達(dá)可導(dǎo)致K562細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥[10]。

1.4 K562/a02細(xì)胞主要耐藥機(jī)制

(1)耐藥細(xì)胞過表達(dá)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物濃度降低是產(chǎn)生耐藥的主要原因，如P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是MDR基因編碼的跨膜糖蛋白，屬于ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至膜外。腫瘤細(xì)胞膜P糖蛋白過度表達(dá)，通過其藥物外排作用將藥物泵出細(xì)胞外，胞內(nèi)藥物濃度下降，導(dǎo)致多藥耐性[11]；(2)凋亡基因的異常，細(xì)胞凋亡是在基因調(diào)控下的一種細(xì)胞自我消亡，是人體組織器官發(fā)育中細(xì)胞清除的正常途徑，當(dāng)細(xì)胞凋亡受到抑制或阻斷時(shí)，細(xì)胞沒有正常凋亡，繼續(xù)增殖就容易誘發(fā)突變。隋晶蕊研究[12]發(fā)現(xiàn)寡霉素可通過線粒體途徑誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞的凋亡；(3)藥物作用靶點(diǎn)的改變，如產(chǎn)生多種耐藥的靶點(diǎn)蛋白，如BCR/ABL基因P-loop區(qū)域、活化P-loop區(qū)域及羧基末端區(qū)域突變，將導(dǎo)致BCR/ABL激酶結(jié)構(gòu)的改變，破壞其與TKI類藥物的結(jié)合，進(jìn)而使其再激活而產(chǎn)生耐藥作用，也產(chǎn)生多藥耐藥 (MDR)。賈祝霞研究發(fā)現(xiàn)[13]耐藥白血病細(xì)胞內(nèi)p-STAT3水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)降低，從而逃避了免疫細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，這可能是耐藥白血病細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)殘留的重要原因之一。也有研究發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制可能涉及過度激活的PI3K通路，通過誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)錄、激活STAT3通路，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞上P糖蛋白的功能與表達(dá)，最終介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生[14]。

2 MiR15b作用機(jī)制

2.1 miRNAs功能

微小RNA是一類19～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小RNA，主要通過結(jié)合下游靶基因mRNA的3'UTR區(qū)，從而導(dǎo)致靶基因mRNA降解，抑制蛋白的翻譯。MiRNA通過調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等多種生物學(xué)行為[15-16]。在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥方面也起到了重要作用[17-18]。MiRNA對(duì)造血干/祖細(xì)胞自我更新能力的維持、造血細(xì)胞的分化、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等過程，發(fā)揮了重要作用。MiRNA可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡[19]。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮作用[20]。MiRNA中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子一樣的特征，在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNA表達(dá)模式具有分化的位相性和時(shí)序性(differential spatial and temporal expression patterns)，提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。MiRNA在人的多個(gè)主要組織和多種細(xì)胞中均起到重要作用，通過調(diào)節(jié)miRNA，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、多藥耐藥，起到更好的治療效果。韋杰合研究[21]發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p可以與WNT2B結(jié)合，miR-218-5p表達(dá)的增加抑制骨肉瘤細(xì)胞143B中WNT2B的蛋白表達(dá)水平，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。MiRNA-184在膠質(zhì)瘤組織中明顯低表達(dá)，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，過表達(dá)miRNA-184可以減少腫瘤細(xì)胞的增殖，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡[22]。上調(diào)miR-145可減少白血病細(xì)胞的增殖，并增加細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路受到抑制有關(guān)[23]。MiRNAlet-7a能顯著抑制HMGA2的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而顯著抑制喉癌細(xì)胞的增殖[24]。MiR-449a/b的低表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并且miR-449a/b能抑制胃癌細(xì)胞增殖[25]。MiR-8085在膀胱癌中表達(dá)降低，過表達(dá)miR-8085可通過干擾TOP2A基因的表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力[26]。MiRNA-196b可能通過靶向抑制IGF2BP1的表達(dá)，抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[27]。MiRNA成員中的miRNA-145是一種癌細(xì)胞抑制基因，可調(diào)控多種目的基因[28]，通過抑制腫瘤細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移等而控制腫瘤的發(fā)展[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞比較，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量較低，上調(diào)其表達(dá)能夠抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)放射敏感性[30]。MiRNA-145低表達(dá)也可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，過表達(dá)miRNA-145能夠抑制卵巢癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，miRNA-145可以作為治療卵巢癌的新靶點(diǎn)[31]。有分析表明，miR-345-5p在前列腺癌患者血清中的表達(dá)較高，能夠?qū)η傲邢侔┘?xì)胞產(chǎn)生影響，高表達(dá)miR-345-5p與前列腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，miR-345-5p可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲[32]。MiR-373表達(dá)下調(diào)可顯著抑制皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其凋亡誘導(dǎo)作用可能與caspase-3活性升高有關(guān)[33]。MiRNA-223-3p在胃癌組織中高表達(dá)，下調(diào)miRNA-223-3p表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與JAK2/ STAT3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)[34]。將miR-106a-5p mimics或siPTEN轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，隨后用Pae處理，研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-106a-5p或抑制PTEN表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Pea對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響，Pea通過下調(diào)miR-106a-5p/PTEN信號(hào)通路蛋白抑制白血病細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[35]。特定miRNA的異常表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)、抗腫瘤藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合以及凋亡相關(guān)途徑從而引起耐藥，miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)的下調(diào)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)有關(guān)，miRNA的異常導(dǎo)致了乳腺癌耐藥的發(fā)生[36]。多種miRNA在乳腺癌中表達(dá)異常，與放療抵抗和多重耐藥有關(guān)[37]。有研究結(jié)果顯示，miR-135a-5p在胰腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)胰腺癌細(xì)胞中miR-135a-5p的表達(dá)水平，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，提高順鉑敏感性，說明miR-135a-5p在胰腺癌中具有重要的作用[38]。上調(diào)miRNA-506能逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，這一過程可能通過miRNA-506調(diào)控多藥耐藥蛋白和凋亡相關(guān)蛋白實(shí)現(xiàn)[39]。

2.2 miR-15b的位置

在ATRA治療 APL的過程中，miR-15b的表達(dá)量急劇增加。miR15b定位于3號(hào)染色體，在人的各個(gè)主要組織和多種細(xì)胞中均有表達(dá)，其中包括免疫系統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，循環(huán)系統(tǒng)的網(wǎng)狀紅細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞。有研究表明沉默惡性黑色素腫瘤中的miR-15b表達(dá)后，細(xì)胞遷移距離、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力均受到顯著抑制[40]。

2.3 miR-15b的功能

靶基因集合功能富集于蛋白激酶活性、GTP結(jié)合蛋白調(diào)控等分子功能，蛋白氨基酸磷酸化、細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過程，提示miR-15b可能在這些生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要功能。孫文陽研究[41]發(fā)現(xiàn)miR-15b在細(xì)胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。黃寶和研究[42]發(fā)現(xiàn)隨著神經(jīng)功能缺損評(píng)分增加，患者血清中miR-15b表達(dá)量升高，而VEGF、Ang-2濃度降低，說明miR-15b表達(dá)可能與神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度有關(guān)。

3 靶基因mRNA降解對(duì)ABCC5的影響

3.1 ABCC5功能

ABCC5是ABCC (ATP-bindingcassette transporter family class C，ABCC) 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的成員，介導(dǎo)眾多內(nèi)源性代謝產(chǎn)物和外源性藥物從細(xì)胞內(nèi)向外轉(zhuǎn)運(yùn)。張鵬研究發(fā)現(xiàn)[43]ABCC5與培美曲塞對(duì)乳腺癌化療耐藥有顯著相關(guān)性。轉(zhuǎn)染ABCC4或者ABCC5可以減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性。李汝平研究[44]發(fā)現(xiàn)ABCC5/MRP5基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的高表達(dá)，有可能提高了化療的耐藥性，降低化療療效，嚴(yán)重影響了預(yù)后。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用順鉑治療的患者，肺癌組織中ABCC5的mRNA水平明顯增高[45]。經(jīng)過化療治療的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，ABCC5表達(dá)水平較高的患者預(yù)后較差[46]。對(duì)5-Fu耐藥的胰腺癌細(xì)胞中，只有針對(duì)ABCC5的RNAi可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞對(duì)5-Fu耐藥[47]。

3.2 miR-15b靶向ABCC5的機(jī)制

近年來發(fā)現(xiàn)miR-15b可以與CCNE1的3'UTR端結(jié)合，抑制下游靶基因CCNE1的表達(dá)[48]，并且與調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白有關(guān)[49]。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-15b能夠與CDK4 mRNA 3'UTR結(jié)合，CDK4的蛋白表達(dá)水平降低[50]。推測(cè)miR-15b是通過結(jié)合下游靶基因mRNA的3'UTR區(qū)從而導(dǎo)致靶基因mRNA降解，抑制蛋白(ABCC5)的翻譯，從而減少耐藥。因?yàn)锳BCC5是介導(dǎo)眾多內(nèi)源性代謝產(chǎn)物和外源性藥物從細(xì)胞內(nèi)向外轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，可導(dǎo)致多藥耐藥。

4 展望

微小RNA家族展現(xiàn)出抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和治療耐藥的特性，決定了可能在治療惡性腫瘤中起到重要作用。