高濃度乙醇發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展

惠繼星，胡 斌，寧艷春，陳希海，岳 軍，王 碩，屈海峰，胡世洋，范 銳

(1.中國石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；2.中國石油吉林石化公司 安全環(huán)保處，吉林 吉林 132021；3.吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林 吉林 132101)

國家“十四五”規(guī)劃中明確提到要全方位加大節(jié)能力度，優(yōu)化能源結(jié)構(gòu)，重點是提高清潔能源比重，減輕對原油和天然氣進(jìn)口持續(xù)上升的依賴，降低進(jìn)口依存度。燃料乙醇作為一種清潔、可再生能源，能有效緩解對化石燃料的依賴、提高能源安全性[1]，對緩解石油短缺、降低環(huán)境污染、節(jié)能減排具有重要意義。但燃料乙醇目前生產(chǎn)成本較高，缺乏市場競爭力，相較汽油無明顯價格優(yōu)勢，導(dǎo)致眾多燃料乙醇企業(yè)瀕臨虧損的邊緣，因此，最大限度地降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本對燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展意義重大。由于高濃度(Very high gravity，VHG)乙醇發(fā)酵技術(shù)在節(jié)能降耗方面具有顯著的優(yōu)勢而備受關(guān)注，被認(rèn)為是乙醇發(fā)酵行業(yè)未來發(fā)展的有效途徑之一。

發(fā)酵成熟醪中乙醇濃度是發(fā)酵工藝的一個重要技術(shù)指標(biāo)，也是發(fā)酵技術(shù)先進(jìn)與否的標(biāo)志。在傳統(tǒng)發(fā)酵中，w(可溶固形物)=20%～24%，而高濃度乙醇發(fā)酵中w(可溶固形物)>30%，與傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵工藝相比，VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)具有成熟醪乙醇濃度高、生產(chǎn)成本低、設(shè)備利用率高、較低能耗與環(huán)境污染及乙醇產(chǎn)率高等優(yōu)點。隨著發(fā)酵技術(shù)的日益發(fā)展進(jìn)步，VHG乙醇發(fā)酵中底物濃度有逐步升高的趨勢[2]。

1 高濃度乙醇發(fā)酵的原理

VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)的原理是采用提高發(fā)酵底物濃度的方法來提高發(fā)酵成熟醪中乙醇的濃度，減少單位乙醇產(chǎn)量所需要處理的物料流總量，進(jìn)而降低乙醇生產(chǎn)中物料的傳輸、加熱、冷卻、精餾及飼料烘干等過程的能耗，同時減少廢液的排放，降低污水處理成本，是目前燃料乙醇生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)之一。

2 高濃度發(fā)酵的優(yōu)缺點

采用VHG發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)乙醇，可以節(jié)約工藝用水，在不增加工廠生產(chǎn)能力的基礎(chǔ)上提高乙醇產(chǎn)量，提高設(shè)備利用率，減少環(huán)境污染，節(jié)能降耗等。此外，VHG乙醇發(fā)酵還有利于抑制乙醇發(fā)酵過程中雜菌的生長和繁殖，生產(chǎn)高蛋白飼料、食品級副產(chǎn)品等[3]。

雖然VHG乙醇發(fā)酵有節(jié)約成本、增加乙醇產(chǎn)出等優(yōu)點，但是VHG發(fā)酵也存在一些問題。在VHG發(fā)酵過程中，隨著底物濃度的提高，隨之而來的是滲透壓及乙醇濃度的升高，酵母細(xì)胞所處的環(huán)境不斷惡化，酵母細(xì)胞生長緩慢，發(fā)酵速率逐漸下降，乙醇生成受到抑制，再加上營養(yǎng)缺乏等因素導(dǎo)致發(fā)酵時間長、發(fā)酵不完全。此外，由于VHG發(fā)酵底物濃度較高，物料流動性變差，使醪液在攪拌、輸送以及加熱冷卻工序的運行都變得十分困難[4]，VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用，很大程度上依賴于低黏度糖化醪液的制備。

3 國內(nèi)外VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)研究概況

發(fā)酵成熟醪中乙醇濃度的高低是衡量乙醇發(fā)酵行業(yè)重要的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，為此人們也在不斷研究和優(yōu)化發(fā)酵過程控制，建立新的發(fā)酵方法，提高發(fā)酵成熟醪乙醇濃度，降低生產(chǎn)成本。

VHG乙醇發(fā)酵條件下，提高發(fā)酵過程中酵母所受脅迫的耐受性，對于VHG發(fā)酵的順利進(jìn)行至關(guān)重要。到目前為止，國內(nèi)外對VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)的研發(fā)大致分為2個方面。一是高耐受性及高產(chǎn)菌種的選育，二是發(fā)酵過程控制與優(yōu)化。

3.1 高耐受性及高產(chǎn)菌種的選育

在菌種選育方面，構(gòu)建、篩選在高糖濃度條件下，乙醇轉(zhuǎn)化效率高的工程菌可能是VHG乙醇發(fā)酵研究的一個重要方向。工程菌的成功構(gòu)建取決于多方面因素，對VHG乙醇發(fā)酵條件下酵母菌的生理生化方面的研究，可能是解決問題的一個重要途徑。

研究人員通過構(gòu)建、篩選得到一株釀酒酵母菌株，乙醇耐受性大幅度提高，與出發(fā)菌株相比，甘油產(chǎn)量明顯降低，乙醇產(chǎn)量明顯提高[5]。顧中鳳[6]通過誘變、選育獲得一株可在高溫和高濃度葡萄糖條件下進(jìn)行發(fā)酵的優(yōu)良突變菌株，發(fā)酵終點φ(乙醇)達(dá)到16.7%。李勇[7]篩選出一株適于VHG乙醇發(fā)酵的菌株，采用分組液化工藝，可使w(殘總糖)降低16.4%，φ(乙醇)提高1.93%。通過基因重組技術(shù)獲得的菌株往往具有較高的生產(chǎn)潛能。吳華昌等[8]從白酒酒糟中篩選出能在φ(乙醇)=18%條件下生長發(fā)酵產(chǎn)酒的菌株。

3.2 發(fā)酵過程控制與優(yōu)化

為了促進(jìn)VHG乙醇發(fā)酵，使酵母菌在各種脅迫條件下保持較高的活性，提高發(fā)酵效率，科研人員開展了多方面的研究，提出了各種應(yīng)對策略，例如通氣、添加氮源、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵工藝控制與優(yōu)化等。

3.2.1 通氣

發(fā)酵液中溶解氧濃度(DO)是重要的影響因素之一，其對酵母細(xì)胞的生長和乙醇代謝具有重要的作用。氧氣有助于增強(qiáng)酵母細(xì)胞抵抗高濃度乙醇的抑制作用，還有利于酵母細(xì)胞的生長，促進(jìn)類脂質(zhì)等存活因子及不飽和脂肪酸的合成。

在VHG乙醇發(fā)酵過程中，由于底物的濃度較高，使物料的黏度升高、流動性變差，進(jìn)而導(dǎo)致氧傳遞受阻，因此在VHG乙醇發(fā)酵過程中應(yīng)提供足夠的溶氧供給，通氣可以提高酵母發(fā)酵初期活性，提高酵母發(fā)酵能力，反之，缺乏氧氣的供應(yīng)，乙醇發(fā)酵過程受到很大抑制，酵母耗糖能力受阻[9]。

在VHG乙醇發(fā)酵過程中，通入微量的氧能夠快速提高發(fā)酵前期酵母細(xì)胞的濃度，減少殘?zhí)橇浚黾右掖忌伤俾屎涂s短發(fā)酵時間[10]。另外，對VHG乙醇分批發(fā)酵進(jìn)行連續(xù)通風(fēng)，酵母細(xì)胞密度和發(fā)酵效率明顯提高[11]。在釀酒酵母VHG乙醇發(fā)酵過程中通入適量的空氣能提高乙醇耐受性及存活率[12]。通氣還可使VHG乙醇發(fā)酵成熟醪中副產(chǎn)物甘油的濃度明顯降低[13]。

3.2.2 添加氮源

氮源是合成蛋白質(zhì)和核酸所不可缺少的營養(yǎng)元素，糖發(fā)酵制備乙醇與氮源有一定關(guān)系。VHG乙醇發(fā)酵過程中，只有添加適量的氮源，才能保證酵母菌健康生長、抵抗較高滲透壓的影響，增加乙醇產(chǎn)出，及時添加氮源對VHG乙醇發(fā)酵至關(guān)重要。

在通常的發(fā)酵中，酵母菌不能利用淀粉質(zhì)原料中的蛋白質(zhì)，加入酸性蛋白酶后，其水解作用可增加發(fā)酵醪液中α-氨基氮的濃度，為酵母提供氮源，直接供酵母利用，促進(jìn)酵母生長繁殖，目前已為國內(nèi)較多燃料乙醇企業(yè)所應(yīng)用。有關(guān)研究表明，以酸性蛋白酶作為氮源進(jìn)行VHG乙醇發(fā)酵，發(fā)酵成熟醪中φ(乙醇)最高達(dá)到15.5%，發(fā)酵時間大幅縮短[14]。

在工業(yè)化大生產(chǎn)中，企業(yè)從成本上考慮，往往選擇添加尿素作為氮源。在酵母菌的VHG乙醇發(fā)酵過程中，添加尿素可明顯提高發(fā)酵醪液中乙醇濃度，提高酵母數(shù)量，此外添加尿素的發(fā)酵醪液中甘油和乙酸濃度明顯低于添加銨鹽及對照組[15]。

酵母膏是一種優(yōu)質(zhì)的天然復(fù)合有機(jī)氮源。有關(guān)研究表明，酵母膏為VHG乙醇發(fā)酵理想的氮源，但是由于酵母膏的價格昂貴，為了降低乙醇生產(chǎn)成本，可以采用價格低廉的尿素和硫酸銨來代替[16]。

3.2.3 發(fā)酵溫度

在乙醇發(fā)酵過程中需要維持酵母菌的生長和生產(chǎn)的最適溫度，這是保證酵母細(xì)胞活性的重要條件。有研究表明，影響VHG乙醇發(fā)酵的因素中，溫度是最主要的因素[17]。在VHG乙醇發(fā)酵過程中，將主發(fā)酵的溫度由34 ℃降為32.5 ℃，發(fā)酵成熟醪φ(乙醇)>16%[18]。對木薯生料VHG乙醇發(fā)酵過程采用梯度降溫控制的方法，使發(fā)酵醪液中φ(乙醇)=16.24%[19]。

3.2.4 發(fā)酵pH值

pH值是微生物生長代謝和產(chǎn)物合成的非常重要的狀態(tài)參數(shù)，是代謝活動的綜合指標(biāo)，因此必須掌握發(fā)酵過程中pH值變化的規(guī)律，及時監(jiān)控，使其處于生產(chǎn)的最佳狀態(tài)。有研究表明，在玉米VHG乙醇發(fā)酵過程中，通過流加氨水控制發(fā)酵液pH≥4.00，發(fā)酵成熟醪中φ(乙醇)=16.40%[20]。

3.2.5 同步糖化發(fā)酵工藝

同步糖化發(fā)酵工藝是采用發(fā)酵與糖化同步進(jìn)行的方法，實現(xiàn)緩慢供糖，使糖濃度保持在較低的水平，避免底物抑制作用。將“同步糖化發(fā)酵”技術(shù)應(yīng)用于木薯VHG乙醇發(fā)酵，最終φ(乙醇)=14.7%，糖化酶用量較常規(guī)乙醇發(fā)酵增加了17%[21]。另外，選擇適宜的糖化酶，可解決同步糖化發(fā)酵過程中定量供糖的問題，利于實現(xiàn)VHG乙醇發(fā)酵[22]。在VHG乙醇發(fā)酵大生產(chǎn)裝置上采用同步糖化發(fā)酵工藝，可使發(fā)酵成熟醪中φ(乙醇)由12%提高至14%[23]。

3.2.6 添加其他營養(yǎng)物質(zhì)

有關(guān)研究表明，在培養(yǎng)基中添加適量的營養(yǎng)物質(zhì)，如海藻糖、肌醇、脂肪酸等，都可有效提高酵母細(xì)胞的乙醇耐受力，易于實現(xiàn)VHG乙醇發(fā)酵。乙醛是酵母乙醇發(fā)酵途徑中的直接前體，乙醛由酵母通過代謝途徑產(chǎn)生，作為代謝的一個節(jié)點，乙醛既能還原成乙醇又能氧化成乙酸。VHG乙醇發(fā)酵過程添加乙醛，發(fā)酵終點的φ(乙醇)=17.0%，比對照組提高約10%[24]。

3.2.7 其他工藝

據(jù)有關(guān)報道，采用分批添加強(qiáng)制循環(huán)生料酒精發(fā)酵工藝能顯著提高發(fā)酵成熟醪乙醇濃度和淀粉利用率[25]。采用酒糟濾液回用技術(shù)可提高發(fā)酵醪酒度近2%[26]。利用固定化酵母技術(shù)進(jìn)行VHG乙醇發(fā)酵，發(fā)酵96 h，φ(乙醇)=17.57%[27]。采用流加的方式進(jìn)行VHG乙醇發(fā)酵，酵母細(xì)胞重復(fù)利用，不需化學(xué)處理，相比傳統(tǒng)發(fā)酵過程，ρ(乙醇)=132.90 g/L[28]。

4 結(jié)束語

VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)有助于進(jìn)一步改善常規(guī)乙醇發(fā)酵終點乙醇濃度低的問題，其不必對現(xiàn)企業(yè)的工藝、設(shè)備等進(jìn)行大規(guī)模改造，就可顯著提高乙醇產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，大幅度提高企業(yè)的盈利能力，符合清潔生產(chǎn)，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，優(yōu)勢顯而易見，因而近年來備受人們關(guān)注，是一項極具應(yīng)用價值的前瞻性技術(shù)，將極大提高目前中國乙醇發(fā)酵工業(yè)的技術(shù)水平，是今后乙醇發(fā)酵工業(yè)所要努力的目標(biāo)和方向。

雖然VHG乙醇發(fā)酵可顯著提高發(fā)酵成熟醪的乙醇濃度，降低產(chǎn)物分離的能耗和乙醇生產(chǎn)成本，但是酵母細(xì)胞生長和發(fā)酵卻面臨初糖濃度高及產(chǎn)物中乙醇濃度高的雙重脅迫，還存在高黏度物料的輸送、副產(chǎn)甘油、液化和糊化不徹底、不均勻、殘總糖高等問題，需要科研人員不斷的進(jìn)行研究和改進(jìn)。VHG乙醇發(fā)酵最根本、最關(guān)鍵的仍然是酵母問題，選育具備更高耐滲透壓能力、更高耐乙醇能力、更強(qiáng)發(fā)酵性能以及更高乙醇轉(zhuǎn)化率的酵母，是實現(xiàn)VHG乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵，還需繼續(xù)研究，推動VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，以便更好地服務(wù)于燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)。