谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在Pichia pastoris GS115 中的表達(dá)及其發(fā)酵條件響應(yīng)面法優(yōu)化

于 凡，劉 雙，陳海清，王紅靜，馬 雯，石 楠，檀建新

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，縮寫為TGase，EC 2.3.13）是一種重要的食品酶［1］，具有催化酰基轉(zhuǎn)移、脫酰胺和蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的賴氨酸與谷氨酰胺共價(jià)交聯(lián)的活性［2］。后者可以改變蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)保水能力和促進(jìn)凝膠形成，提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值［3］。因此，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的修飾，從而改善蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和功能［4］，在食品、醫(yī)藥、紡織等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值［5］。TGase 在自然界中分布廣泛，包括豚鼠肝臟、植物以及微生物［6］。微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶又稱為MTG（Microbial transglutaminase），與動(dòng)植物來源的TGase 相比，MTG 具有分子量小、Ca2+獨(dú)立性、較高的反應(yīng)速率和熱穩(wěn)定性以及較寬的酰基供體底物專一性等優(yōu)點(diǎn)，更適合工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用［4］。同時(shí)，因?yàn)槲⑸锷L快，產(chǎn)量大，效率高，所以達(dá)到工業(yè)規(guī)模的用于食品改性的商業(yè)化MTG 都是由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的［7］。然而，MTG 也存在一些缺點(diǎn)，如天然宿主鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基相對昂貴，發(fā)酵工藝復(fù)雜，增加了大規(guī)模生產(chǎn)的成本和復(fù)雜程度［8］。因此，異源重組表達(dá)則成為生產(chǎn)MTG 的一種可行的技術(shù)手段［9］。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛用于外源重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，可同時(shí)生產(chǎn)分泌蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白［10］。目前，已有500 多種來自哺乳動(dòng)物、植物、酵母和細(xì)菌的外源蛋白在畢赤酵母中獲得了成功表達(dá)［11］。畢赤酵母具有操作簡單、生物量和蛋白產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，并且它是甲醇營養(yǎng)型酵母，具有強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1，可嚴(yán)格調(diào)控和驅(qū)動(dòng)高水平的蛋白表達(dá)，能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)水解、折疊、二硫鍵形成和糖基化等翻譯后修飾。這些特點(diǎn)使畢赤酵母成為大規(guī)模生產(chǎn)重組酶的理想宿主［12］。許多在原核系統(tǒng)中以非活性形式表達(dá)的蛋白質(zhì)在畢赤酵母中都實(shí)現(xiàn)了活性形式的表達(dá)［13］。

利用畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的特性，本研究將含有吸水鏈霉菌TGase 基因的pPIC9K-prokex-TGase 重組分泌表達(dá)載體在畢赤酵母GS115 中表達(dá)，并通過Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法Response surface methodology（RSM）評價(jià)并優(yōu)化了TGase 的發(fā)酵條件，以期為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 巴斯德畢赤酵母GS115 及pPIC9K 空載質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；吸水鏈霉菌TGase 基因克隆來自本實(shí)驗(yàn)室保存的吸水鏈霉菌 （Streptomyces hygroscopicus）菌株107.3，pPIC9K- pro-kex-TGase 由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 參考Invitrogen 畢赤酵母表達(dá)手冊，配制YPD 培養(yǎng)基、MD 培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基BMGY、誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY。DH5α 感受態(tài)、 Solution Ⅰ購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；SalⅠ等酶購自大連寶生物公司；PCR Mix、Super Marker（100-10 kb）、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成。

1.1.3 儀器與設(shè)備 SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博迅公司； H-1850R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀公司；PCR 儀德國Biometra 公司；756P 紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜公司；Gene Pulser Xcell電穿孔儀，美國Bio-Rad 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組畢赤酵母GS115 的構(gòu)建 取-80 ℃保存含pPIC9K-pro-kex-TGase 重組載體的大腸桿菌甘油保藏管，按1%接種量接種于5 mL 含0.1%（v/v）氨芐抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜，收集菌體并使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用salⅠ酶切處理重組質(zhì)粒pPIC9K-pro-kex-TGase使之線性化，再電轉(zhuǎn)化至GS115 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)并整合到基因組中，利用菌落PCR 及酶活性比色法對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 重組GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase 搖瓶培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá) 挑取陽性轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K-prokex-TGase，活化后按1% 接種量接種于含25 mL BMGY 生長培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)25 h。參照畢赤酵母表達(dá)手冊方法，4 ℃、5 000 r/min 收集菌體并轉(zhuǎn)接到BMMY 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23 ℃、200 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每24 h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度0.5%。取誘導(dǎo)結(jié)束后的發(fā)酵液，12 000 r/min 離心10 min 收集上清液，即為粗酶液。

1.2.3 酶活測定及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 酶活測定使用經(jīng)典氧肟酸比色法［14］，取50 μL 粗酶液置于1.5 mL 離心管中，加入50 μL A 液（CBZ、 鹽 酸 羥 胺、GSH、0.2 mol/L Tris-HAc）混和均勻，放入37 ℃水浴鍋溫浴10 min，加 50 μL B 液（3 mol/L HCL、5% FeCl3、CCL3COOH）終止反應(yīng)并顯色。反應(yīng)體系經(jīng)12 000 r/min 離心1 min 后，取100 μL 轉(zhuǎn)入96 孔酶標(biāo)板中，在525 nm 波長下測定上清液的吸光值；另取50 μL 粗酶液煮沸滅活，其余步驟同上，作為對照用于樣品測定吸光度值時(shí)調(diào)零。dispase Ⅱ處理粗酶液在37 ℃水浴鍋溫浴20 min［15］。

根據(jù)L- 谷氨酸-γ- 單羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，y= 0.031 8x+0.042 4（x為L- 谷 氨 酸-γ- 單 羥 肟 酸 濃 度mmol/L，y為OD525下的吸光值A(chǔ)，R2=0.999 8）， 計(jì)算酶活力值。酶活單位定義為37 ℃下每分鐘催化形成1 μmol 的L-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量。使用12%分離膠對酶提取液進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分析［16］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析旨在尋找顯著變量及其與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系，以便對變量水平進(jìn)行管理以獲得期望的結(jié)果輸出［17］。因此根據(jù)TGase 酶活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析了TGase 酶活力和誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵參數(shù)的關(guān)系，通過Design-Expert V8.0.6 專業(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、進(jìn)行分析和預(yù)測。

1.3.1 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì) PB 設(shè)計(jì)［18］可 以快速、有效的從本試驗(yàn)的多個(gè)發(fā)酵條件中篩選出主要因素。根據(jù)前期單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用PB設(shè)計(jì)對接種密度、溫度、初始pH、甲醇濃度、誘導(dǎo)時(shí)間共5 個(gè)因素對TGase 生產(chǎn)的影響進(jìn)行研究，試驗(yàn)次數(shù)N=12，每個(gè)因素選取高低兩個(gè)水平（表1）。

表1 PB 設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 Factors and levels of PB design

1.3.2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)（BBD）和響應(yīng)面方法（RSM）在PB 設(shè)計(jì)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過RSM 進(jìn)一步優(yōu)化具有顯著影響的因素。通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)3 因素2 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，再以粗酶液的酶活為響應(yīng)值。使用二次多項(xiàng)式模型來探索顯著因素變量和響應(yīng)變量之間的關(guān)系。最終目標(biāo)是通過建模和分析影響響應(yīng)值的多個(gè)獨(dú)立變量來優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)［19］。數(shù)學(xué)模型如下：

Y是預(yù)測響應(yīng)值，α0為常數(shù)項(xiàng)，αi為因子影響系數(shù)，αij為因子間交互響應(yīng)系數(shù)，αii為二階影響系數(shù)因子。XiXj自變量的水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase 誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 分析

將構(gòu)建并篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后收集粗酶液進(jìn)行酶活檢測，粗酶液可直接檢測出較低的酶活性，說明粗酶液中含有正確折疊且有活性的成熟酶TGase（mTGase），推測可能是由于GS115 菌株自身的kex2 酶識別Lys-Arg 位點(diǎn)并對酶原pro-kex-TGase 酶切形成了mTGase 所致。粗酶液經(jīng)dispase Ⅱ處理后酶活力達(dá)到（0.314±0.002）U/mL， 而GS115 空白菌株、GS115/pPIC9K 空載菌株在相同條件下發(fā)酵上清液中沒有檢測到MTG 酶活，說明兩者不表達(dá)TGase，而含有酶原pro-kex-TGase基因的陽性轉(zhuǎn)化子菌株能夠很好地表達(dá)酶原且具有TGase 活性。

對收集的粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果見（圖1）。泳道1、2 分別是GS115、GS115/pPIC9K 發(fā)酵上清液，未見蛋白條帶，說明GS115、GS115/pPIC9K 本身不表達(dá)TGase 酶蛋白；泳道3為GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase 發(fā)酵上清液，在約45 kD 處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，這與S. hygroscopicus谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶原的蛋白分子理論大小基本一致，說明TGase 獲得了很好地表達(dá)且不存在糖基化修飾。然而，在胞外粗酶液中直接檢測到了TGase 酶活力，說明該表達(dá)系統(tǒng)也直接生成了分泌到胞外的折疊正確的mTGase，理論上其分子大小約為38 kD，但在SDS-PAGE 圖中只有1 條45 kD 的TGase 酶原條帶（圖1），說明可能只有很少的酶原經(jīng)過kex2 酶活化成mTGase，故在SDS-PAGE 膠圖中未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。

圖1 TGase 粗酶液的SDS-PAGE 電泳分析Fig. 1 SDS-PAGE electrophoresis analysis of TGase crude enzyme solution

2.2 用PB 設(shè)計(jì)篩選TGase 表達(dá)的主要因素

所有試驗(yàn)除研究因素外其它條件均保持一致，PB 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 PB 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 PB experimental design and results

確定顯著性因素并進(jìn)行方差分析（見表3）?！癙rob ＞F”（P值）值表明模型和因子的顯著性水平?！癙rob＞F”值小于0.050 0 表示顯著，大于0.100 0表示不重要。PB 結(jié)果分析5 個(gè)因素對TGase 的生產(chǎn)影響，按重要性排序?yàn)椋篨3＞X4＞X1＞X2＞X5。其中X3、X4 對TGase 酶活力有顯著影響（P＜0.01），選擇X3、X4 和X1（誘導(dǎo)pH、甲醇濃度、接種密度）進(jìn)一步優(yōu)化。

表3 PB 設(shè)計(jì)結(jié)果分析Table 3 Analysis of PB design results

2.3 用RSM 優(yōu)化顯著因子

2.3.1 RSM 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用響應(yīng)面中的BBD 法對顯著因子編碼，誘導(dǎo)起始pH（A）、甲醇濃度（B）和誘導(dǎo)起始接種密度（C）進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，研究3 個(gè)因子的相互作用和最佳水平。獲得多元二次方程如下所示：

Y為預(yù)測TGase 酶活力，A、B 和C 分別為3 個(gè)顯著因子的編碼值。每個(gè)因子有3個(gè)編碼水平（1，0，-1），共進(jìn)行了17 次運(yùn)行。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 4 Experimental design of response surface

2.3.2 回歸分析 對該方程2.3.1（2）進(jìn)行回歸系數(shù)顯著性檢測和方差分析。

表5 結(jié)果表明，模型F值為61.69 意味著該模型具有顯著性，只有0.01%的可能性，因?yàn)樵胍舳a(chǎn)生較大的“F值”?！癙值”即小于0.050 0 表示模型項(xiàng)是有效的，在這種情況下，A、B、C、A2、B2、C2是重要的因子項(xiàng)。大于0.100 0 的值表示因子項(xiàng)不重要，AB、AC、BC 不重要。失擬項(xiàng)為2.16.意味著缺乏擬合相對于純誤差不顯著，有23.55%的可能性出現(xiàn)這樣大的失擬值是由于噪聲。對可信度進(jìn)行分析，模型R2=0.987 5，變異系數(shù)（C.V. %）為4.3，說明模型的擬合程度和可信度較高?！癆deq Precision”測量信噪比，比率大于4 是所期望的。該模型25.987 的比率表明信號充足。說明此模型可用于模擬TGase 酶活力的理論預(yù)測。

表5 響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 5 ANOVA of the quadratic model of response surface

2.3.3 響應(yīng)面各因子相互作用的關(guān)系 為了更好地理解各因子對TGase 生產(chǎn)的影響，使用Design-Expert.V8.0.6 獲得了各因子的2D 等高線圖和3D 響應(yīng)曲面（見圖2 ～4）。通過響應(yīng)曲面和等高線圖直觀地觀察到AB，AC 和BC 之間相互作用。等高線圖呈橢圓時(shí)，表示兩因子間具有顯著的交互作用，其它則不顯著。圖2（b）圖4（b）的曲面較陡，說明pH 和甲醇濃度、甲醇濃度和接種密度的交互作用對酶活性影響較顯著。圖3（b）曲面較平緩，說明pH 和接種密度的交互作用對酶活性影響不顯著。圖2（a）圖4（a）的等高線趨向橢圓形，說明pH和甲醇濃度、甲醇濃度和接種密度的交互作用明顯。通過沿輪廓的長軸和短軸移動(dòng)來獲得變量的統(tǒng)計(jì)最優(yōu)值。在等高線圖中最小的橢圓中得到最高的預(yù)測值。預(yù)測最佳發(fā)酵條件：誘導(dǎo)初始pH 7，甲醇濃度2.07%，接種密度OD6006.27，預(yù)測響應(yīng)值為1 U/mL。

圖2 誘導(dǎo)pH 值和甲醇濃度影響酶活力的等高線a 和響應(yīng)面曲圖bFig. 2 The contour a and response surface plot b of induced pH and methanol concentration affecting enzyme activity

圖3 誘導(dǎo)pH 值和接種密度影響酶活力的等高線a 和響應(yīng)曲面bFig. 3 The contour a and response surface b of induced pH density affecting enzyme activity

圖4 甲醇濃度和接種密度影響酶活力的等高線a 和響應(yīng)曲面bFig. 4 Contour a and response surface b of methanol concentration and inoculation density affecting enzyme activity

2.3.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化驗(yàn)證 經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)合實(shí)際情況調(diào)整最佳誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)接種密度OD600為6，pH 為7，甲醇濃度為2.0%，溫度23 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間72 h，進(jìn)行3 組平行發(fā)酵試驗(yàn)，在此條件下獲得的粗酶液經(jīng)dispase Ⅱ處理，檢測到TGase 酶活力為（1.03±0.075 ）U/mL；與響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)所得預(yù)測值相近，證明該模型較好的預(yù)測了試驗(yàn)結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

到目前為止，人們嘗試了不同來源的TGase 在P.pastoris中的表達(dá)，但酶活力普遍不高，例如2019 年，Yang 等［20］試驗(yàn)表明，表達(dá)弗氏鏈霉菌TGase 酶活力達(dá)到0.7 U/mL，且證明TGase 活性能夠引起于豬肉、雞肉和大豆蛋白的交聯(lián)重構(gòu)。2019 年Li 等［13］研究表明，表達(dá)玉米TGase 獲得可溶性TGase 酶活力達(dá)到0.889 U/mg。而來源于S. hygroscopicus的TGase 的在酵母中異源表達(dá)研究較少，萬丹研究報(bào)道的重組吸水鏈霉菌TGase 在解脂耶氏酵母中表達(dá)酶活力為1.06 U/mL［15］。P. pastoris作為應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，對MTG 的大量表達(dá)還有巨大的發(fā)展?jié)摿Α１狙芯繕?gòu)建的重組吸水鏈霉菌TGase的P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)，既可以產(chǎn)生大量酶原蛋白，又可以直接產(chǎn)生具有酶活性的mTGase，其原因可能是GS115 菌株自身的kex2 蛋白酶識別KR 位點(diǎn)并酶切了表達(dá)的TGase 酶原形成了有活性的mTGase，這在一定程度上實(shí)現(xiàn)了本研究的設(shè)計(jì)目標(biāo)。Bader et al［21］研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母可產(chǎn)生kex2 蛋白酶，該酶的存在為mTGase 形成提供了可能性。但在發(fā)酵條件優(yōu)化前后，SDS-PAGE 電泳中均未出現(xiàn)明顯的mTGase 蛋白條帶，說明優(yōu)化前后被kex2 酶活化的TGase 酶原仍然只是一小部分，還有很大的改造潛力。目前關(guān)于提高畢赤酵母TGase 表達(dá)量的方法，報(bào)道較多是啟動(dòng)子改造、信號肽替換、高拷貝菌株篩選等［22］，該重組表達(dá)系統(tǒng)未來可以通過共表達(dá)kex2 酶、使用專一性切割TGase 酶原區(qū)的TAMEP蛋白酶、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化等方法來獲得更高的酶活力，有助于其工業(yè)化應(yīng)用。

本 研 究 經(jīng) 過Plackett-Burman（PB） 和Box-Behnken（RSM）試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，結(jié)果表明優(yōu)化后獲得的TGase 酶活力比未優(yōu)化發(fā)酵條件前提高了近3.6 倍，說明將PB 設(shè)計(jì)和RSM 試驗(yàn)方法相結(jié)合，用于篩選顯著影響因子并揭示因子間的相互關(guān)系的優(yōu)化方法可行，Yu et al［19］曾使用該方法優(yōu)化生產(chǎn)胞外溶菌酶的發(fā)酵條件，使該酶得到了高效表達(dá)。

本研究構(gòu)建了表達(dá)吸水鏈霉菌TGase 的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase，在接種密度OD600為6，pH 為7，甲醇誘導(dǎo)濃度為2.0%，溫度23 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間72 h 的優(yōu)化條件下，TGase 最大酶活力達(dá)到1.1 U/mL，并實(shí)現(xiàn)了有活性mTGase 的胞外分泌表達(dá)，為MTG 生產(chǎn)和分子改造提供了新思路。