響應面法優(yōu)化核桃花茶浸提工藝

曹智翔，李升云，于晨晨，田益玲,2,3

（1. 河北農業(yè)大學 食品科技學院，河北 保定 071000；2. 河北省（邢臺）核桃產業(yè)技術研究院，河北 邢臺 054000；3. 河北省核桃工程技術中心，河北 邢臺 054000 ）

核桃（Juglans regiaL.）為胡桃科胡桃屬植物，在全球廣泛種植。有研究報道稱核桃雄花產量與核桃相當，核桃雄花提取物在中國民間被用于治療各種疾病，如癌癥、皮炎、濕疹、慢性支氣管炎等疾病［1］；核桃雄花醇提物能夠降血糖，提高糖尿病大鼠胰高血糖素水平［2］；核桃雄花中多酚、黃酮含量豐富，含有多個天然活性基團，具有預防心腦血管疾病、抗衰老、抗氧化、降血脂等功能［3-4］，核桃雄花中存在大量的生物活性化合物，其提取物能夠預防太陽紫外輻射對人體皮膚造成的損傷［5］；此外，核桃雄花中氨基酸種類豐富，富含對人體有益的多種礦質元素及維生素。目前對核桃的研究多集中于核桃仁、核桃殼、核桃青皮及核桃葉，而對核桃雄花的研究鮮有報道，市場上對核桃雄花的認知度較低，對核桃花茶中的功能性成分及其沖泡工藝的研究很少。

多酚、黃酮具有清除自由基的功效，能夠預防及治療心腦血管、高血壓等多種慢性疾病，在臨床上應用廣泛［6］，而游離氨基酸對茶葉品質具有一定的影響，茶葉香氣和滋味均與之有關［7］，此外，游離氨基酸可被人體直接吸收，是VE、葉酸等營養(yǎng)素的良好來源［8］。浸提工藝會影響茶葉的相關品質指標，考慮到溫度、時間及茶水比之間的交互作用尚不明確，且核桃花茶中的主要溶出物含量尚無數據支撐，本文依據其產量高、儲存時間短、開發(fā)利用度低以及營養(yǎng)價值高的特點，將核桃雄花按照制茶工藝制成核桃花茶，采用單因素試驗、Box-Behnken試驗設計和響應面分析對核桃花茶浸提工藝進行優(yōu)化［9］。為核桃雄花的開發(fā)利用提供一定的理論指導，對核桃花茶的浸提工藝進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻核桃‘京藝1 號’雄花，河北省河北綠嶺有限公司生產基地（東經114°4′，北緯37°3′）。

沒食子酸及蘆丁標準品、水合茚三酮、福林酚 北京索萊寶科技有限公司；Al（NO3）3、NaOH、NaNO2、Na2CO3、無水乙醇等試劑，福晨（天津）化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純，試驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

UV-1700PC 紫外可見分光光度計，上海美析儀器分析有限公司；DD-8M2 冷風機，大華制冷設備有限公司大華制冷設備廠；LG10 型冷凍干燥機，新陽速凍設備制造有限公司；高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃花茶的制備 選擇新鮮的核桃雄花水洗、瀝干，經真空冷凍干燥后，置于粉碎機中粉碎，炒青，備用。

1.3.2 核桃花茶主要成分的測定

（1）多酚含量的測定

多酚含量的測定采用福林酚比色法［10］，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，結果以沒食子酸當量（mg/g 干物質）來表示，每個處理重復3 次。

（2）黃酮含量的測定

黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法［11］，以蘆丁為標準品繪制標準曲線，結果以蘆丁當量（mg/g 干物質）來表示，每個處理重復3 次。

（3）游離氨基酸含量的測定

游離氨基酸含量的測定參照GB/T 8314—2013 ＜茶：游離氨基酸總量的測定＞，每個處理重復3 次。

1.3.3 單因素試驗與響應面優(yōu)化試驗 分別考察時間、溫度、茶水比對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響，試驗過程如下：準確稱取1 g 制備好的核桃花茶于茶包中，在浸提時間（5、10、15、20、25、30、35、45、60 min），茶水比（1∶50、1∶75、1∶100、1∶125、1∶150、1∶175、1∶200 g/mL）， 浸提溫度（60、70、80、90、100 ℃）的條件下浸提，浸提結束后過濾并準確移取一定體積的浸提液，分別對比分析各因素不同水平的測定結果。

在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平進行響應面優(yōu)化分析，核桃花茶試驗因素與水平參見表1。

表1 核桃花茶浸提液的因素和水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design of walnut flower tea extract

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

本試驗所得數據以平均值±標準偏差（x±s）來表示，每個處理重復3 次，利用Origin 86、Expert-Design 8.0.6 軟件進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 浸提時間對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響 多酚、黃酮等化合物會受到光、熱等物理化學反應的影響，加工時間和加工方式都會影響食品中多酚、黃酮等化合物的提?。?2］，而浸提時間對核桃花茶中有效成分的提取也具有一定的影響。由圖1 可知，隨著浸提時間的延長，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量逐漸增加，黃酮與游離氨基酸浸提量隨浸提時間的延長增加明顯，而多酚浸提量隨時間的延長呈緩慢增長趨勢，45 min 時核桃花茶中的黃酮、游離氨基酸浸提量達到峰值，隨時間的延長不再有增長趨勢，反而有下降趨勢，研究結果與Bengardino 等人的研究結果［13］一致，提取時間太長會導致多酚、黃酮等化合物之間發(fā)生縮合反應，部分多酚、黃酮等化合物會被氧化。

2.1.2 浸提溫度對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響 溫度會影響多酚、黃酮等化合物的溶出，適宜的溫度會加速分子的運動，多酚、黃酮等分子的擴散速率也會加快［14］，提取溫度會對化合物組成和生物活性產生影響［15］。在浸提時間為30 min，茶水比為1∶100，浸提溫度不同的條件下，核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸的浸提量影響不同。由圖2 可知，游離氨基酸隨浸提溫度的升高其浸提量變化不明顯，60 ～90 ℃平緩增長，90 ℃時呈降低的趨勢，而多酚、黃酮的浸提量隨溫度的升高，其浸提量逐漸增加，且變化趨勢基本一致，但溫度太高會導致雜質的溶出且有益成分易遭到破壞，影響浸提物的質量，因此本研究90 ℃的浸提溫度較適宜。

圖2 浸提溫度對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction of polyphenols, flavonoids and free amino acids in walnut staminate flower tea

2.1.3 茶水比對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響 茶水比會影響核桃花茶有效成分的溶出，多酚、黃酮通常與植物中的大分子物質結合成穩(wěn)定的物質，而不同體積分數的溶劑會影響植物多酚的提?。?6］，本試驗探討浸提時間30 min，溫度80 ℃，茶水比不同的條件下對其浸提量的影響。由圖3 可知，隨著茶水比的增加，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量均呈先增加后減少的趨勢，當茶水比為1∶100 時游離氨基酸、黃酮達到最大值，其中游離氨基酸含量為52.85 mg/g，黃酮含量為58.96 mg/g， 當茶水比大于1∶100 時游離氨基酸及黃酮得率逐漸降低，而當茶水比為1∶125 時，多酚含量達到最大值32.93 mg/g。這可能是由于隨著茶水比的增加，核桃花茶中的其他成分也隨之溶出，破壞了多酚、黃酮的結構，導致其浸提量有所降低。

圖3 茶水比對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響Fig.3 Effect tea-water ratio on extraction of polyphenols, flavonoids and free amino acids in walnut staminate flower tea

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面設計及試驗結果 根據單因素試驗結果確定因素水平及范圍，以浸提溫度、茶水比、浸提時間為響應變量，多酚、黃酮、游離氨基酸浸提量為響應值，進行響應面優(yōu)化分析，利用Box-Behnken 試驗設計原理對因素水平進行編碼，結果如表2 所示。

表2 響應面設計及響應值Table 2 Response surface design and response values

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert 軟件對表2 試驗數據進行多元回歸擬合，得到多酚浸提量Y1、黃酮浸提量Y2和游離氨基酸浸提量Y3對浸提溫度A，茶水比B和浸提時間C的二次多項回歸模型為：

Y1（mg/g）=40.75+4.74A+0.19B+2.06C+0.045AB+0.84AC+1.52BC-2.99A2-2.60B2-3.90C2

回歸結果分析見表3，表4，表5。

表3 核桃花茶多酚浸提回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of polyphenol from walnut staminate flower tea

表4 核桃花茶黃酮浸提回歸模型方差分析結果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of flavone from walnut staminate flower tea

表5 核桃花茶游離氨基酸浸提回歸模型方差分析結果Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of free amino acids from walnut staminate flower tea

由表3 ～5 可知，溫度對多酚、黃酮及游離氨基酸的影響均為極顯著；時間對游離氨基酸的影響為顯著，對多酚、黃酮的影響較?。徊杷葘Χ喾蛹包S酮的影響均表現為極顯著，對游離氨基酸的影響為顯著。通過響應面建立的回歸模型可知：多酚浸提模型P＜0.000 4，而黃酮與游離氨基酸浸提模型P＜0.000 1，表明核桃花茶中主要溶出物的浸提回歸模型極顯著，且其失擬項均不顯著，表示核桃花茶中3 種有效成分的擬合度良好，試驗誤差相對較少，其中多酚的浸提回歸模型擬合度為0.961 5，黃酮的浸提回歸模型擬合度為0.991 2，游離氨基酸回歸模型擬合度0.976 2，因此核桃花茶中的多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量可以用此模型來分析和預測。

2.2.3 響應面分析與條件優(yōu)化 兩變量交互作用的顯著性可以用三維響應面圖和二維輪廓圖來表示，圓形表示變量間交互作用不顯著，橢圓形與之相反，響應面圖坡度越陡，響應指標對響應因素的變化影響越大［17］。本試驗固定不變其他試驗因素，考察交互項對浸提效果的影響。由回歸方程可繪制核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸的響應面及等高線圖，如圖4 ～6 所示。

當浸提時間為40 min 時，由圖4 可知，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨著浸提溫度和茶水比的升高和增加而增加，其中游離氨基酸浸提量在溫度95 ℃左右時較為穩(wěn)定，隨著浸提溫度的繼續(xù)升高，浸提量變化不明顯，多酚、黃酮的浸提量變化趨勢一致，溫度越高浸提量越多，但溫度超過95 ℃會有降低趨勢，這是因為溫度太高會導致多酚、黃酮類物質分解，影響浸提效果，而適當的升高溫度則可以加劇分子運動，提高浸提得率［18-19］。由圖4 中的等高線圖可以看出，溫度和茶水比對黃酮及游離氨基酸的浸提量交互作用顯著，而多酚浸提量隨溫度上升變化較為緩慢，交互作用不顯著。

當茶水比為1∶100（g/mL）時，由圖5 可知，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨著浸提溫度的上升而增加，其中多酚及游離氨基酸浸提量在溫度95 ℃ 左右時較為穩(wěn)定，隨著浸提溫度的繼續(xù)升高，浸提量變化不明顯，而黃酮浸提量隨著浸提溫度的升高，浸提量有著微弱的下降趨勢，隨著浸提時間的延長，在40 min 前浸提量均有著增長的趨勢，之后浸提量不會有所增長反而有明顯下降趨勢，這是因為隨著時間的延長，多酚黃酮類化合物達到飽和而受到 空氣中氧氣的影響，其含量有微弱的下降趨勢［20］。由圖5 中的等高線圖我們可以看出，浸提溫度對核桃花茶浸提物的影響較浸提時間更為顯著；溫度和時間對黃酮浸提量交互作用顯著，而對多酚及游離氨基酸交互作用不顯著。

圖4 核桃花茶浸提過程中溫度和茶水比交互作用對浸提量影響的響應面及等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effect of temperature and water ratio on extraction volume from walnut staminate flower tea

圖5 核桃花茶浸提過程中溫度和時間交互作用對浸提量影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effect of temperature and time on extraction volume from walnut staminate flower tea

當浸提溫度為90 ℃時，由圖6 可知，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨著茶水比的增加而增加，其中游離氨基酸含量在茶水比1∶95 g/mL 左右時保持穩(wěn)定，隨著浸提時間的延長，浸提量變化不明顯， 有研究表明茶水比越大，有效成分的浸提率越低，這是由于隨著茶水比的增加受茶湯中的其他溶出物影響所致［21］。隨著浸提時間的延長，多酚浸提量變化較為明顯而黃酮浸提量變化不明顯，其中多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨時間的延長增加之后有著顯著的下降趨勢，且茶水比的高低與這種趨勢無關。

圖6 核桃花茶浸提過程中茶水比和時間交互作用對浸提量影響的響應面及等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effect of ter-water ratio and time on extraction volume from walnut staminate flower tea

由圖6 中的等高線圖可以看出，浸提時間比茶水比對核桃花茶主要溶出物的影響作用更為顯著；多酚浸提量在茶水比1∶90 之前，茶水比較浸提時間影響作用顯著，之后則相反，而游離氨基酸與黃酮浸提量受茶水比的影響較顯著。

利用 Design-Expert 對核桃花茶中的多酚、黃酮及游離氨基酸的浸提模型進行計算，將響應值重要性設定為同等重要，選取模型最優(yōu)浸提工藝為：浸提溫度96.83 ℃，茶水比1∶99.66 g/mL，浸提時間41.82 min，在此條件下多酚浸提量為42.98 mg/g， 黃酮浸提量為69.28 mg/g，游離氨基酸提取量為67.98 mg/g。

檢驗所得結果的可靠性，在上述優(yōu)化后的浸提條件下對核桃花茶進行浸提，結合茶葉沖泡的實際條件，將浸提工藝參數修正為：浸提溫度97 ℃，茶水比1∶100 g/mL，浸提時間42 min。在此條件下重復浸提3 次，實際測得多酚浸提量為42.01 mg/g， 黃酮浸提量為68.16 mg/g，游離氨基酸浸提量為67.14 mg/g，與理論預測值相比，多酚的誤差率為0.97%，黃酮的誤差率為1.12%，游離氨基酸的相對誤差為0.84%。因此，基于響應面所得的優(yōu)化浸提工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對核桃花茶中的浸提工藝進行了優(yōu)化，確定了核桃花茶的最優(yōu)工藝條件為：溫度97 ℃、時間42 min、茶水比1∶100 g/mL，在此條件下核桃花茶的主要溶出物多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量較高，浸提效果最好，最優(yōu)工藝條件的實際值與模型預測值相近，驗證了模型的可靠性。最佳沖泡條件下浸提的核桃花茶食用價值高，對于核桃雄花及其花茶的進一步研究與開發(fā)具有重要意義；此外，可對不同品種核桃花茶的主要溶出物含量進行比對分析，利用數理統(tǒng)計對各品種核桃花茶進行分類；對核桃花茶的品質指標具有一定的檢測意義。綜上，核桃花茶沖泡工藝的研究可以為消費者及廣大研究者提供1種簡單、高效的沖泡條件。