抑制樹突細胞MMP-13基因對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣炎癥模型的影響

韓 陽 張芯蕊 陳 娟 劉文琪 李曉東

沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，沈陽，110024

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現的自身免疫性炎癥性疾病，該病難以治愈，常反復發(fā)作，嚴重影響患者生活質量。銀屑病病因復雜，受遺傳、感染、外傷、精神、自身免疫、環(huán)境變化等多種因素影響[1]。免疫功能異常在其發(fā)病中具有重要作用，研究發(fā)現，T細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)、角質形成細胞及他們分泌的細胞因子共同參與銀屑病發(fā)病[2]。

目前認為，銀屑病是T細胞免疫功能紊亂、Th1細胞過度活化的自身免疫性疾病。DC是體內抗原遞呈功能最強的細胞，未成熟的DC從外周遷移到皮膚，在啟動T細胞介導的特異性免疫應答中起關鍵作用，并且能調控T細胞向Th1樣或Th2樣細胞方向發(fā)育，因此，DC在銀屑病發(fā)病機制中的作用越來越受到重視?；|金屬蛋白酶(MMPs)屬于鋅內肽酶家族，參與多種不同的細胞過程。它們可作為酶降解細胞外基質蛋白，同時也參與多種免疫反應[3,4]。MMP-13是膠原酶亞家族成員之一，主要在軟骨細胞和成骨細胞以及多種腫瘤細胞中表達[4,5]。最近研究發(fā)現，MMP-13也在小鼠骨髓來源的DC和小鼠肺DC中表達。小鼠體外細胞學研究發(fā)現,MMP-13可調節(jié)DC的多種功能，包括激活CD8+T細胞，參與MHC-I表面表達，當DC細胞MMP-13表達受抑制時，其分泌的細胞因子IL-12p70、IL-23p19、IL-6減少[3]。許多研究發(fā)現，IL-6是銀屑病細胞因子網絡中的關鍵成分，參與銀屑病的發(fā)病，并且與浸潤的細胞成分和角質形成細胞的增殖有關，IL-23在銀屑病的維持和發(fā)展過程中均發(fā)揮一定的作用[6,7]。IL-17A是輔助性T細胞17分泌的細胞因子，在銀屑病發(fā)病中起重要作用[8]。

目前尚無描述DC細胞表達的MMP-13與銀屑病之間相關性的研究。因此，我們應用Cre-lox系統構建DC特異性敲除MMP-13基因的小鼠模型分析DC細胞的MMP-13基因對銀屑病的影響，初步探索DC細胞表達的MMP-13在銀屑病發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選用12周齡的雌性C57BL/6小鼠(WT)和Cre-lox系統構建DC特異性敲除MMP-13基因小鼠(MMP-13LOX/LOX小鼠)(C57BL/6背景)作為研究對象。

1.2 儀器與試劑 5%咪喹莫特乳膏(艾達樂，3M，美國)，凡士林乳膏(強生，美國)，4%甲醛固定液(遼寧新興試劑有限公司，中國)，OCT組織包埋劑(Lecia，德國)，異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司，中國)，無水乙醇(遼寧新興試劑有限公司，中國)，浸蠟脫蠟透明劑 (南昌雨露實驗器材有限公司，中國)，中性樹膠 (中國上海標本模型廠，中國)，DAB試劑盒 (福州邁新生物科技開發(fā)有限公司，中國)，DAB染色液(羅氏診斷產品有限公司，美國)，抗小鼠IL-1beta抗體(Servicebio，中國)，抗小鼠IL-6抗體(Servicebio，中國)，抗小鼠IL-23抗體(Bioss，中國)，抗小鼠IL-17A抗體(Servicebio，中國)，免疫組化二抗試劑盒，10%山羊血清封閉液，抗體液稀釋液及50×檸檬酸鈉抗原修復液(北京索萊寶生物科技有限公司，中國)。

1.3 方法

1.3.1 組織學觀察 根據基因類型及處理條件，小鼠隨機分為4組，包括WT對照組(WT-Blank)、MMP-13lox/lox對照組(MMP-13lox/lox-Blank)、咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)誘導的WT實驗組(WT-IMQ)、IMQ誘導的MMP-13lox/lox實驗組(MMP-13lox/lox-IMQ)，每組3只小鼠。小鼠造模實驗重復兩次，共計36只小鼠。小鼠自由飲食喂養(yǎng)，鼠房保持干燥、通風，室溫21～26℃，濕度30%～50%。依據隨機數字表對小鼠進行隨機分組，正式實驗前兩天，剃除小鼠背部2 cm×3 cm區(qū)域毛發(fā)。實驗組小鼠給予5%的IMQ乳膏62.5 mg/只，均勻涂抹在小鼠背部裸露區(qū)域。背部連續(xù)涂抹IMQ乳膏6天。對照組小鼠給予同等劑量凡士林，余處理過程同上。每日觀察背部紅斑、鱗屑及皮損增厚情況。給藥第7天處死小鼠后取背部皮損組織，固定、脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后光鏡下觀察組織學改變。

1.3.2 大體觀察 依據小鼠背部紅斑、鱗屑、皮膚增厚等表現(0～4分)進行獨立評分，評分規(guī)則如下：0=沒有，1=輕度，2=中度，3=明顯，4=非常明顯；累積分數=(紅斑+鱗屑+增厚，0～12分)用于表示皮膚炎癥的程度。

1.3.3 免疫組化染色 將小鼠背部組織標本常規(guī)固定、脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋，制成6 μm厚切片，經烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水、抗原修復后，分別滴入IL-6、IL-1β、IL-23一抗孵育過夜，第2天孵育二抗，經二氨基聯苯胺顯色后，再進行復染、鹽酸分化，最后脫水、中性樹膠封片。光鏡下觀察IL-6、IL-1β、IL-23、IL-17A表達情況并采集圖像，用Image-Pro Plus 6.0對圖像量化分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理。正態(tài)分布數據用(均數±標準差)表示，獨立樣本t檢驗用于比較兩組間的差異。P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 小鼠皮損臨床表現和PASI評分 應用咪喹莫特乳膏的第2天，WT小鼠的背部開始出現紅斑及少量鱗屑，用藥后3～5天，紅斑加重，皮膚明顯增厚，鱗屑增多。與WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠背部紅斑略淡，鱗屑及皮膚增厚情況輕于WT組，給藥后第3天達高峰，皮損表現相對溫和。MMP-13LOX/LOX小鼠背部皮損在給藥后第6天輕于WT小鼠，見圖1。

IMQ誘導的WT小鼠皮損PASI評分顯示，用藥第2天小鼠背部皮膚即出現紅斑、增厚和鱗屑，第3天紅斑表現達高峰。鱗屑及皮膚厚度持續(xù)加重，第4天最為顯著(呈典型的銀屑病樣改變)。MMP-13LOX/LOX小鼠的PASI評分顯示，用藥第2天小鼠背部皮膚即出現紅斑、增厚和鱗屑。紅斑在給藥后第4天呈下降趨勢，鱗屑及皮膚肥厚在給藥后第三天達高峰，之后趨于平穩(wěn)。IMQ誘導的兩組，累積PASI評分顯示MMP-13LOX/LOX小鼠的皮損評分低于WT小鼠(圖2)。外用凡士林的對照組小鼠，包括MMP-13LOX/LOX和WT，整個實驗期間背部皮膚未出現肉眼可見的炎癥改變，其PASI評分趨近于0分。

WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：對照組小鼠

2.2 組織病理學 HE染色觀察凡士林組(WT組及MMP-13LOX/LOX組)小鼠皮膚結構正常。與WT對照組小鼠相比，IMQ誘導的銀屑病樣小鼠表皮棘層肥厚、表皮突延長，真皮細胞浸潤，海綿水腫。在IMQ誘導的銀屑病樣模型中，MMP-13LOX/LOX小鼠和WT小鼠棘層厚度分別為(374.40±76.50)μm和(581.74±78.72)μm，差異具有顯著性(獨立樣本t檢驗，t=3.272，P=0.031，圖3)。

與WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠真皮浸潤細胞較少。 統計學分析顯示，IMQ誘導后WT實驗組小鼠和MMP-13LOX/LOX實驗組小鼠的真皮細胞數分別為(41.67±9.02)個/視野和(34.67±6.66)個/視野，兩者之間無顯著性差異(獨立樣本t檢驗，t=1.082，P=0.34，圖4)。

2.3 免疫組化 免疫組化結果顯示，在銀屑病樣小鼠模型中，IL-6蛋白在WT小鼠皮損中的表達量明顯高于MMP-13LOX/LOX小鼠，差異具有顯著性(獨立樣本t檢驗，t=8.116，P=0.001，圖5)。

與MMP-13LOX/LOX小鼠相比，WT小鼠皮損中IL-1β表達水平顯著升高，差異具有顯著性(獨立樣本t檢驗，t=2.916，P=0.043，圖6)。

與MMP-13LOX/LOX小鼠相比，WT小鼠皮損中IL-23表達水平略升高，無顯著性差異(獨立樣本t檢驗，t=1.193，P=0.299，圖7)。

與MMP-13LOX/LOX小鼠相比，WT小鼠皮損中IL-17A表達水平略升高，無顯著性差異(獨立樣本t檢驗，t=0.422，P=0.695，圖8)。

2a:紅斑評分(0～4分);2b:鱗屑評分(0～4分);2c:皮損厚度評分(0～4分);2d:總計分數(0～12分);*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：對照組小鼠

圖3 銀屑病樣小鼠模型中，MMP-13LOX/LOX小鼠和WT小鼠棘層厚度比較 *P<0.05； WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：對照組小鼠 圖4 銀屑病樣小鼠模型中，MMP-13LOX/LOX小鼠和WT小鼠真皮浸潤細胞數比較 ns：無顯著性差異；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特

*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：對照組小鼠

*P<0.05； WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：對照組小鼠

ns：無顯著性差異；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：對照組小鼠

ns：無顯著性差異；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：樹突細胞特異性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：對照組小鼠

3 討論

樹突狀細胞是天然免疫和適應性免疫的專職抗原呈遞細胞。在生命周期中，DC前體遷移到組織中，作為前哨細胞抵御入侵者，在攝取抗原并處理后，DC遷移到淋巴結，激活T淋巴細胞。DC可表達基質金屬蛋白酶，DC或MMPs的失調在多種疾病中都有報道，如移植功能障礙和炎癥性疾病等。對DC細胞中MMPs調控的深入研究，將有助于靶向調控DC，改善疾病[3,9,10]。MMP-13特殊的研究意義在于MMP-13存在特異性小分子抑制劑，與其他廣泛表達于所有白細胞亞群的MMP-2和-9相比，MMP-13具有更強的DC限制性表達模式。因此，抑制MMP-13可以更精確地靶向調控DC，而不影響其他免疫過程。小鼠體外細胞學研究發(fā)現，MMP-13可調節(jié)DC的多種功能，包括激活CD8+T細胞，參與MHC-I表面表達，同時，在DC細胞MMP-13表達受抑制時，其分泌的細胞因子IL-12p70、IL-23p19、IL-6減少[3]。有研究發(fā)現，銀屑病患者血清中及皮損處MMP-13表達升高[11]，也有研究報道，在小鼠銀屑病樣模型中MMP-13表達上調，提示MMP-13可能參與銀屑病的發(fā)生[12]。為進一步探索DC細胞表達的MMP-13在銀屑病發(fā)病機制中的作用，本研究構建有效的MMP-13LOX/LOX小鼠動物模型具有重要意義。

本文采用局部皮膚涂抹5%咪喹莫特乳膏的方法誘導銀屑病樣皮損的發(fā)生，模擬人類銀屑病的發(fā)病過程。建模結束后，首先通過肉眼觀察小鼠不同組別皮膚紅斑、鱗屑及皮膚增厚的情況，并對PASI評分進行分析，發(fā)現在IMQ誘導的銀屑病樣小鼠模型中，與WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠皮損表現溫和，僅有輕度的棘層肥厚和真皮細胞浸潤。表明MMP-13可能影響銀屑病樣皮炎的嚴重程度和病理表現。通過免疫組化研究發(fā)現，MMP-13影響銀屑病相關細胞因子的表達，與WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠皮損中IL-1β、IL-6表達下調，而IL-23和IL-17A表達無明顯改變。

許多研究發(fā)現，IL-6是銀屑病細胞因子網絡中的關鍵成分，參與銀屑病的發(fā)病，與銀屑病的嚴重程度相關[13]。IL-6是一種重要的炎癥介質，是輔助性T細胞Th1型細胞因子的重要組成成分，具有促炎和抗炎雙重作用，能通過對內皮細胞的影響參與炎癥反應，也可參與角質形成細胞及T細胞增殖和活化[14]。研究發(fā)現，銀屑病患者IL-6主要是由DC和內皮細胞產生，銀屑病皮損中IL-6表達增強。IL-6可促進STAT3的磷酸化過程，并抑制人體調節(jié)性T細胞，參與銀屑病發(fā)生和發(fā)展[15]。

本研究發(fā)現，MMP-13LOX/LOX小鼠皮損中IL-6的表達下調與體外小鼠細胞在DC細胞MMP-13表達受抑制時研究結果一致，提示MMP-13可能通過影響IL-6的表達影響銀屑病的炎癥程度。

有研究報道表皮IL-1系統的調節(jié)紊亂與銀屑病皮損的形成密切相關[16]。IL-lβ不僅參與炎癥反應，而且還可誘導多種細胞產生淋巴因子。Barnawi等[17]研究發(fā)現銀屑病患者血清中IL-1β水平高于正常對照組，臨床癥狀好轉前后IL-1β水平隨有效治療降低，提示IL-1β與銀屑病的發(fā)病有一定關系。劉瑋等[18]研究發(fā)現IL-1β參與了銀屑病的皮損形成?？滓徽娴萚19]研究發(fā)現，IL-1β在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，且與皮損嚴重程度相關。本研究對IMQ小鼠皮損處IL-1β的表達進行研究發(fā)現，MMP-13LOX/LOX小鼠皮損中IL-1β的表達下調，提示DC細胞的MMP-13可能通過影響IL-6的表達影響銀屑病的炎癥程度。

IL-23主要由抗原遞呈細胞分泌。研究顯示，銀屑病患者皮損組織中DC、單個核細胞所分泌的IL-23表達水平增強[20]。尋常型銀屑病患者血清中IL-23表達水平高于正常對照組，表明IL-23的高表達為銀屑病患者免疫異常表現之一。同時，IL-23能刺激輔助T細胞分泌IL-17和IL-22，對真皮的炎癥和表皮的增生有促進作用[21]。盡管體外小鼠細胞學研究發(fā)現DC細胞MMP-13表達受抑制時，其分泌的細胞因子IL-23p1減少，但本文通過檢測DC細胞敲除MMP-13小鼠銀屑病模型中皮損處IL-23和IL-17A的表達，未見明顯差異，其原因有待進一步研究。

綜上，我們通過構建特異性敲除DC細胞MMP-13基因的MMP-13LOX/LOX小鼠，應用咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣模型，發(fā)現DC細胞敲除MMP-13小鼠銀屑病樣模型中皮損處IL-6及IL-1β的表達下調，表明DC表達的MMP-13參與銀屑病炎癥因子IL-6及IL-1β的表達，提示DC細胞表達的MMP-13可能通過影響炎癥因子的表達參與銀屑病的發(fā)病，但其機制需進一步深入研究。