凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病病原分離鑒定及耐藥性分析

林 楠

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002)

近年來(lái)隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，各類(lèi)新型對(duì)蝦傳染性疾病頻發(fā)，如急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND)[1]、肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)病[2]、虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)病[3]等，已經(jīng)嚴(yán)重威脅我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。急性肝胰腺壞死病是近年全球范圍內(nèi)對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖影響較為嚴(yán)重的急性傳染病之一?；疾?duì)蝦主要臨床癥狀表現(xiàn)為肝胰腺萎縮、顏色變淺，空腸空胃，甲殼變軟，失去活力等，常為急性死亡，死亡率高達(dá)100%。由于該病主要感染放養(yǎng)后7～30 d的蝦苗，又被稱(chēng)為早期死亡綜合征(Early mortality syndrome，EMS)，可感染包括凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)和中國(guó)明對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)等對(duì)蝦種類(lèi)[4]。該傳染病是由攜帶含毒力基因pirAVP和pirBVP質(zhì)粒pVA1的弧菌引起的，該質(zhì)粒能夠表達(dá)毒力蛋白PirAVP和PirBVP。目前已報(bào)道可引起AHPND的病原菌有副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、歐文氏弧菌(Vibrioowensii)、坎貝氏弧菌(Vibriocampestris)等[5-7]。2019年7月，福州市某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦暴發(fā)死亡，死亡率約70%，發(fā)病對(duì)蝦臨床癥狀符合典型AHPND癥狀。本研究對(duì)疑似患AHPND的對(duì)蝦進(jìn)行了病原分離鑒定、致病性和耐藥性分析，以期掌握該病原的生物學(xué)基本特征，為AHPND的流行病學(xué)研究和防控技術(shù)開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用蝦

患病凡納濱對(duì)蝦樣品于2019年7月采自福建省福州市某養(yǎng)殖場(chǎng)，個(gè)體全長(zhǎng)為6.2～7.3 cm?；貧w感染實(shí)驗(yàn)用健康凡納濱對(duì)蝦來(lái)源于福州另一家養(yǎng)殖場(chǎng)，全長(zhǎng)為4.1～5.5 cm。實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖水溫為(28±1)℃，按照正常對(duì)蝦養(yǎng)殖方式管理。實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)用蝦暫養(yǎng)1周。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀來(lái)自BIO-RAD公司，型號(hào)：T100TMThermal Cycler；凝膠成像儀來(lái)自Bio-Rad，型號(hào)：GelDoc XR+；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)來(lái)自梅里埃公司，型號(hào)：VITEK 2 Compact；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)來(lái)自BRUKER公司，型號(hào)：microflex LT。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

TCBS(Thiosulfate-citrate-bile salt-sucrose agar，硫檸膽蔗瓊脂)、TSA(Tryptic soy agar，胰蛋白胨大豆瓊脂)、TSB(Tryptic soy broth，胰蛋白胨大豆肉湯)、弧菌顯色培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板均購(gòu)自廣東環(huán)凱公司，核酸提取試劑盒、PCR premix試劑盒均購(gòu)自寶生物工程公司。藥物敏感性試驗(yàn)所用抗生素類(lèi)原料藥均由全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站提供，包括氨芐青霉素、硫酸新霉素等14種藥物。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原分離與鑒定

1)細(xì)菌分離

在無(wú)菌條件下用接種環(huán)蘸取患病對(duì)蝦肝胰腺組織，劃線接種于TCBS培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基和弧菌顯色培養(yǎng)基固體平板，于28℃恒溫倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)特征。對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其個(gè)體形態(tài)和染色特性。挑取固體平板上占優(yōu)勢(shì)的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)后用40%甘油保存于-80℃冰箱。

2)回歸感染實(shí)驗(yàn)

分離菌株劃線接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度至5×108CFU/mL。健康凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分成2個(gè)組(實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組)，每組30尾，每組設(shè)3個(gè)平行。

實(shí)驗(yàn)組：將300 mL濃度為5×108CFU/mL的菌液離心沉淀，等體積滅菌海水重懸，加入盛有2 700 mL滅菌海水的養(yǎng)殖桶中，充氣；將30尾健康實(shí)驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦置于其中浸浴15 min。將100 mL濃度為5×108CFU/mL的菌液加入盛有15 L滅菌海水的養(yǎng)殖桶中，將浸浴后的實(shí)驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦移入其中充氣養(yǎng)殖持續(xù)感染，每6小時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦變化。實(shí)驗(yàn)期間正常投喂和換水。

對(duì)照組：參照實(shí)驗(yàn)組處理方法，滅菌海水不加菌液處理。

3)菌株的生化鑒定

分離菌株劃線接種于血瓊脂平板，于28℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株的生化鑒定。

4)菌株的分子生物學(xué)鑒定

參考賈丹等[8]的方法，對(duì)菌株相關(guān)基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。菌株核酸提取步驟參照Viral RNA/DNA Extraction Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)。取PCR管分別加入引物(10 mmol/L)1 μL，模板DNA 1 μL，Premix Taq預(yù)混試劑12.5 μL，DEPC水9.5 μL，混勻，瞬時(shí)離心。16s rRNA反應(yīng)程序?yàn)椋合?4℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性1 min，55℃退火1 min 20 s，72℃延伸2 min，以上作35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃保溫。其余基因反應(yīng)程序參照各引物來(lái)源文獻(xiàn)(表1)。用TAE緩沖液配制含GelRed染料的1.5%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物120 V恒壓凝膠電泳，置于凝膠成像儀觀察，拍照。產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析。

表1 菌株分子生物學(xué)鑒定所用引物Tab.1 The primer sequences used in this study

5)菌株的MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定

分離菌株劃線接種于血瓊脂平板，于28℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，均勻涂布靶板，待干燥后30 min內(nèi)加基質(zhì)液覆蓋，使用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀鑒定。

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn)

分離菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。將供試藥物配制成200 mg/L初始濃度，在96孔板按10倍倍比稀釋成11個(gè)藥物梯度，依次加入120 μL濃度為106CFU/mL的待測(cè)菌懸液；置于(28±2)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察各孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最高稀釋度作為供試菌株該藥物的最小抑菌濃度(MIC)。從肉眼判定無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的每孔中取100 μL待測(cè)菌液分別移種至瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后，觀察能殺死99.9%接種的細(xì)菌(即每個(gè)平板不超過(guò)5個(gè)菌落)的最低抗菌藥物濃度，即為供試藥物的最低殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離與鑒定

2.1.1 菌株分離情況及形態(tài)特征

從患病對(duì)蝦肝胰腺組織中分離得到1株優(yōu)勢(shì)菌，命名為FJLV01。該菌在TCBS、TSA、弧菌顯色培養(yǎng)基平板上均生長(zhǎng)良好。如圖1所示，在弧菌顯色培養(yǎng)基平板上呈紫色，在TCBS平板上菌落呈藍(lán)綠色，菌落圓形，邊緣較整齊，半透明，直徑約2～4 mm。菌株革蘭氏染色呈陰性，顯微鏡下形態(tài)為稍彎曲的短桿狀。

2.1.2 病原回歸感染

疑似患急性肝胰腺壞死病的凡納濱對(duì)蝦活力減弱、攝食減少，樣品體色發(fā)白，蝦殼變軟，肝胰腺明顯萎縮蒼白?；貧w感染后的凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)AHPND典型癥狀，即肝胰腺萎縮、顏色變淺、空腸空胃、活力變?nèi)醯?圖2)，與疑似患急性肝胰腺壞死病的對(duì)蝦樣品癥狀一致，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦在72 h內(nèi)全部死亡，對(duì)照組無(wú)異常。取實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦肝胰腺、腸道，使用AHPNDPirvpA&PirvpB分子生物學(xué)鑒定方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性。對(duì)感染病蝦進(jìn)行細(xì)菌分離和生化鑒定，顯示病蝦的肝胰腺、腸道組織含副溶血弧菌。

注：A為菌株在TCBS培養(yǎng)基上形態(tài)；B為菌株在弧菌顯色培養(yǎng)基上形態(tài)；C為菌株革蘭氏染色40×顯微觀察結(jié)果。

注：A為對(duì)照組對(duì)蝦；B為實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦。

2.1.3 16S rRNA擴(kuò)增情況和系統(tǒng)發(fā)育分析

基于16S rRNA序列構(gòu)建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)可知，該分離菌株與副溶血弧菌、哈維氏弧菌等歸屬在同一分支里，即與弧菌聚為一類(lèi)，這表明該分離菌株為弧菌屬。

2.1.4 菌株的生化鑒定

VITEK 2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)分離得到菌株的生化指標(biāo)鑒定結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，分離得到的菌株為副溶血弧菌，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的符合概率為93%。

表2 菌株的生理生化特性Tab.2 Physiology and biochemistry characteristics of strain FJLV01

2.1.5 MALDI-TOF質(zhì)譜快速鑒定

菌株的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。菌株的兩次檢測(cè)均出現(xiàn)相同的特征峰，且與標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)中副溶血弧菌 DSM 11058 DSM的特征峰基本一致，系統(tǒng)評(píng)分2.31(+++)，表示可鑒定到種的水平，判定為副溶血弧菌。

2.1.6 菌株的毒力基因分析

毒力基因分析結(jié)果顯示，菌株的PirvpA、PirvpB、PirvpA&PirvpB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性(圖6)，目的條帶大小分別約為284、392、230 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST序列比對(duì)分析，與已知的以上三種基因序列相似性均達(dá)99%以上。菌株的耐熱溶血毒素基因Tdh和耐熱溶血毒素相關(guān)基因Trh的擴(kuò)增結(jié)果則均為陰性。

注：A為PirvpA基因擴(kuò)增結(jié)果；B為PirvpB基因擴(kuò)增結(jié)果；C為PirvpA & PirvpB基因擴(kuò)增結(jié)果。泳道1、2以菌液為模板；泳道NC為陰性對(duì)照；泳道PC為陽(yáng)性對(duì)照。

2.2 菌株的耐藥性分析

參考CLSI，M45 3rd Edition，菌株的耐藥性分析結(jié)果見(jiàn)表3，可看出分離得到的該病原菌對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶等6種藥物敏感；對(duì)氨芐西林鈉、鹽酸土霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素等4種藥物耐藥；對(duì)硫酸新霉素、恩諾沙星等2種藥物則表現(xiàn)為中介。

表3 菌株的藥物敏感性分析結(jié)果Tab.3 Drug susceptibility of strain FJLV01 μg/mL

3 討論

2009年中國(guó)首次報(bào)道了急性肝胰腺壞死病引起的對(duì)蝦急性死亡[13]，隨后在越南、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、墨西哥等國(guó)家相繼有該病發(fā)生[14]。2013年5月，國(guó)際水產(chǎn)聯(lián)盟(GAA)和聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)先后宣布AHPND病原為副溶血弧菌的特異變種。國(guó)內(nèi)學(xué)者針對(duì)AHPND的致病機(jī)理、病原特性、防控方法等方面做了大量研究，也取得了一定的進(jìn)展[15-17]。相關(guān)學(xué)者分離了副溶血弧菌、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)等急性肝胰腺壞死病致病菌[18]，本研究從福州某養(yǎng)殖場(chǎng)患病凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織分離出一株攜帶毒力基因PirvpA和PirvpB的副溶血弧菌，這與相關(guān)研究結(jié)果相一致。

3.1 副溶血弧菌的毒力基因

副溶血弧菌廣泛存在于海岸和海水中，作為人類(lèi)食源性致病菌，能引起腸胃炎和敗血癥，目前其已成為許多沿海國(guó)家細(xì)菌性食物中毒的首位病原菌[19]。副溶血弧菌的致病機(jī)理目前仍未十分清楚，但有兩個(gè)致病因子已明確，即由Tdh基因編碼的耐熱直接溶血毒素和由Trh基因編碼的相對(duì)耐熱溶血毒素[20-21]。本研究對(duì)分離的副溶血弧菌進(jìn)行了以上兩個(gè)毒力基因的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。但pirAVP和pirBVP基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，這兩種毒力基因可編碼毒力蛋白PirABVP，該蛋白是AHPND的致病因子。這一結(jié)果與賈丹等[8]的研究結(jié)果相一致。

3.2 AHPND致病菌的分離鑒定方法

在GB/T 4789.7—2008中，TCBS和弧菌顯色培養(yǎng)基都是副溶血弧菌檢測(cè)推薦使用的培養(yǎng)基[22]。TCBS培養(yǎng)平板因其成本低、使用方便(僅需觀察菌落為黃色或綠色)，而被廣泛應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖一線AHPND的初篩，但在準(zhǔn)確性方面卻有較大局限。不攜帶含毒力基因pirAVP和pirBVP的副溶血弧菌或不能利用蔗糖的非副溶血弧菌不會(huì)引起AHPND，但均可在TCBS培養(yǎng)基上形成綠色菌落。而攜帶pirAVP和pirBVP基因的能利用蔗糖的弧菌，如歐文氏弧菌、坎貝氏弧菌等，在TCBS培養(yǎng)基上為黃色菌落卻能引起AHPND[23]。因此，診斷AHPND的檢測(cè)方法應(yīng)采用能更加準(zhǔn)確地檢測(cè)pirAVP和pirBVP毒力基因的分子生物學(xué)方法，如普通PCR、等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的2020年水生動(dòng)物防疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證中推薦用于檢測(cè)致急性肝胰腺壞死病弧菌(VAHPND)的方法即為套式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。

目前，常用于水產(chǎn)病原微生物鑒定的方法為生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法，由于MALDI-TOF MS設(shè)備費(fèi)用較昂貴，該技術(shù)應(yīng)用在水產(chǎn)病原菌的相關(guān)報(bào)道仍較少。MALDI-TOF MS技術(shù)是近幾年興起的用于微生物(細(xì)菌、酵母菌和真菌等)快速鑒定的新技術(shù)，其通過(guò)測(cè)定不同微生物獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)將測(cè)定的蛋白質(zhì)和多肽按分子量大小進(jìn)行排列，形成蛋白質(zhì)和多肽指紋圖譜，通過(guò)不同微生物指紋圖譜的特征模式峰進(jìn)行菌株的鑒定。目前，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于常見(jiàn)的人和動(dòng)物病原菌的快速檢測(cè)鑒定，如沙門(mén)氏菌(Salmonellasp.)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)和阪崎腸桿菌(Bntorobatersakazakii)等[24-25]。相信隨著技術(shù)的逐漸成熟和成本降低，MALDI-TOF MS技術(shù)能夠在水產(chǎn)病原微生物鑒定方面發(fā)揮更大的作用。

3.3 AHPND的防控措施

本研究分離的副溶血弧菌菌株對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考等6種藥物敏感，而對(duì)氨芐西林鈉、鹽酸土霉素等4種藥物耐藥，該結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究藥敏分析結(jié)果不盡相同[8]。這與分離菌株來(lái)源地區(qū)的地理特點(diǎn)、用藥習(xí)慣和養(yǎng)殖技術(shù)不同有關(guān)，長(zhǎng)期大量使用抗菌藥物會(huì)促使副溶血弧菌產(chǎn)生耐藥性。目前，大多數(shù)養(yǎng)殖戶(hù)在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中均會(huì)對(duì)養(yǎng)殖水體“菌相”進(jìn)行調(diào)控，盲目使用抗菌藥物容易破壞水體“菌相”，且造成耐藥致病菌的擴(kuò)散，因此在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中抗菌藥物的使用更需慎重。

對(duì)凡納濱對(duì)蝦種蝦和蝦苗進(jìn)行病原檢測(cè)并選擇不攜帶病原的種蝦和健康蝦苗，是目前對(duì)蝦AHPND最有效的防控措施之一。郭書(shū)林等[26]對(duì)福建省9家規(guī)?；布{濱對(duì)蝦苗種繁育場(chǎng)進(jìn)行AHPND檢測(cè)，在90份患病幼蝦樣本中檢出VPAHPND陽(yáng)性22份，顯示對(duì)蝦苗種具有較高的病原感染和病害暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，推動(dòng)對(duì)蝦苗種產(chǎn)地檢疫工作，降低病原跨區(qū)域傳播風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于防控包括AHPND在內(nèi)的對(duì)蝦主要傳染病具有重大意義。

4 結(jié)論

本研究從患病凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織中分離到一株攜帶毒力基因PirvpA和PirvpB的副溶血弧菌，該菌株對(duì)甲砜霉素、氟苯尼考等6種藥物敏感；對(duì)氨芐西林鈉、鹽酸土霉素等4種藥物耐藥。該研究為AHPND的流行病學(xué)研究和防控技術(shù)開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)資料。