偽狂犬病毒重組gG抗原片段的原核表達及其間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法的建立

李 琪，郭嬌嬌，阮文科

(北京農(nóng)學院動物科學技術學院，北京 102206)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR又名Aujeszky's disease，AD)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一種急性傳染病，可引起包括豬、綿羊、牛、犬在內(nèi)的35種動物發(fā)病，且豬是其唯一自然宿主[1-2]。在中國，偽狂犬病是規(guī)?；B(yǎng)殖場的常見病[3]。

偽狂犬病毒主要侵害豬的神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)肢體抽搐等癥狀；妊娠母豬出現(xiàn)繁殖障礙，并且可垂直傳播給仔豬，造成仔豬死亡；種公豬失去配種能力等[4]。該病沒有特效藥，只能通過對病豬注射高免血清，健康豬進行緊急接種，治療效果不佳，給養(yǎng)殖場造成嚴重的經(jīng)濟損失[5]。做好防疫是預防本病的關鍵措施[6]。在加強免疫接種的同時，合理的診斷測定方法也十分重要[7]。

該研究旨在針對TK-/gG-雙基因缺失疫苗建立偽狂犬病毒酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法，通過檢測偽狂犬病毒gG蛋白的抗體，從而區(qū)分出疫苗接種豬和野毒感染豬，為養(yǎng)殖場進行大范圍檢測免疫效果和感染情況提供科學有效的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

偽狂犬病毒Beijing14-1株由北京農(nóng)學院動物科學技術學院獸藥與疫病防控實驗室保存；BL21感受態(tài)細胞購自全式金生物技術有限公司；pET-32a質(zhì)粒購自鼎國昌盛生物技術有限責任公司；待檢豬血清來自規(guī)?；i場。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs、Buffer、T4 DNA連接酶、ProteinIso?Ni-NTA Resin、DNA膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；EcoRⅠ和HindⅢ購自takara公司；96孔板購自corning公司；HRP標記羊抗豬二抗購自北京冠星宇公司；BSA購自Biotopped公司；DNA和蛋白Marker、質(zhì)粒提取試劑盒購自索萊寶公司、His標簽一抗購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 引物設計

根據(jù)NCBI中公布的偽狂犬病毒全基因組序列(登錄號：NC-006151)，運用DNAstar protean軟件分析gG基因主要抗原區(qū)域并設計特異性引物，預期擴增長度為414 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物：5′-CGGAATTCTACGCCGACTACTACGACG-3′(EcoRⅠ)，下游引物：5′-CCAAGCTTGGGTCGGCTCCGG-3′(HindⅢ)。

1.4 重組質(zhì)粒pET-32a-gG的構建

以偽狂犬病毒DNA為模板，用1.3中設計的引物，通過PCR方法擴增偽狂犬病毒gG部分核酸序列。PCR反應體系(20 μL)：Buffer 2 μL，dNTPs 1 μL，模板1 μL，上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 14.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化，并將回收產(chǎn)物和pET-32a質(zhì)粒分別用EcoRⅠ，HindⅢ進行雙酶切，再將兩者用T4連接酶連接；連接體系為pET-32a酶切產(chǎn)物2 μL，PCR產(chǎn)物13 μL，5×T4 DNA Ligase Buffer 4 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，連接溫度為25 ℃，連接15 min。將獲得的重組質(zhì)粒按照常規(guī)方法轉化大腸桿菌DH5α中，挑取陽性菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測序鑒定，由上海生工公司進行測序。pET-32a載體含有可與插入基因融合表達的His標簽，測序鑒定后獲得重組表達質(zhì)粒pET-32a-gG。

1.5 重組質(zhì)粒的誘導表達與純化

將重組質(zhì)粒pET-32a-gG轉化入表達菌BL21中，于菌液OD600=0.6左右，加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)進行誘導表達，同時設未經(jīng)誘導的對照組。誘導表達4 h后，通過SDS-PAGE檢測表達情況。為探究gG蛋白以何形式表達，將菌液超聲破碎后上清和沉淀分開處理，并通過SDS-PAGE檢測。再對最佳誘導條件進行探究，并在此條件下對誘導上清進行Western Blot鑒定，分別使用His單抗作為一抗檢測gG蛋白，偽狂犬病毒陽性豬血清作為一抗檢測蛋白反應原性。最后用全式金ProteinIso?Ni-NTA Resin進行蛋白純化，并獲得His標簽融合表達的重組gG蛋白片段。

1.6 偽狂犬病毒重組gG蛋白片段抗體間接ELISA方法的建立及血清樣品檢測

1.6.1 偽狂犬病毒重組gG蛋白片段抗體間接ELISA方法的建立 經(jīng)過抗原包被濃度、抗體稀釋度以及封閉液和反應條件的優(yōu)化，最終建立檢測步驟。

包被：向96孔板中加入小片段gG抗原1.092 μg和抗原包被液100 μL，37 ℃ 2 h或4 ℃過夜。洗液200 μL洗滌，3次，每次靜置3 min。

封閉：向每孔中加入封閉液200 μL，37 ℃ 1 h或4 ℃過夜。洗液200 μL洗滌，3次，每次3 min。

加樣：分別在陰性對照孔、陽性對照孔加入陰性對照、陽性對照各100 μL(50倍稀釋)，待檢孔第1孔加待檢血清100 μL(50倍稀釋)，后孔對待檢血清做倍比稀釋，不要觸及孔底和孔壁，輕晃混勻。

溫育：用封板膜封板后置37 ℃，30 min。洗液200 μL洗滌，3次，每次3 min。

加酶標二抗：每孔加酶標抗體100 μL(用二抗稀釋液20000倍稀釋)。

顯色：顯色劑A液與顯色劑B液等量混勻，每孔100 μL，37 ℃避光顯色10 min。

終止：每孔加終止液50 μL。

測定：15 min內(nèi)，以450 nm波長檢測每孔OD值。結果判定：S/N≥2.1可判為陽性。S是待檢孔的OD450平均值；N是陰性孔的OD450平均值。

1.6.2 血清樣品檢測 在1.6.1所述的最佳條件下，運用本試驗建立的偽狂犬病毒 gG重組蛋白間接ELISA方法對樣品進行檢測。檢測樣品來自不同規(guī)?；i場的血清樣本共93個，其中包括gG缺失苗免疫的試驗豬血清30個、未注射疫苗但具有非gG缺失苗母源抗體的試驗豬血清48個以及非gG缺失疫苗免疫過的豬血清15個。

2 結 果

2.1 重組質(zhì)粒誘導表達后菌液、上清及沉淀的SDS-PAGE鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-gG轉化入表達菌BL21中，并進行誘導表達。pET-32a-gG質(zhì)粒在經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導后，在40～50 kD之間出現(xiàn)目的條帶，未經(jīng)誘導的菌液未出現(xiàn)目的條帶，見圖1A。

為確定目的蛋白的存在形式，將菌液超聲破碎后離心，分別對上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。上清中有大量表達帶，沉淀中未見表達帶，表明目的蛋白以可溶的形式存在于上清中，見圖1B。

2.2 重組偽狂犬病毒 gG抗原片段Western Blot鑒定

在1 mmol/L IPTG，30 ℃，250 r/min的最佳誘導條件下，對誘導的上清進行Western Blot鑒定，分別使用His標簽單抗和偽狂犬病毒陽性豬血清作為一抗，HRP標記羊抗豬二抗，結果見圖2。兩種方法均能檢測到目的條帶。

2.3 樣品檢測

用1.6.1所述的gG-ELISA測定方法檢測來自不同規(guī)?；i場的血清樣品共93個，判定標準：S/N≥2.1可判為陽性。S是待檢孔的OD450平均值；N是陰性孔的OD450平均值。陽性對照為感染偽狂犬病毒野毒的豬的陽性血清，陰性對照為未感染偽狂犬病毒野毒并且也未接種偽狂犬病毒疫苗的豬血清。

檢測豬場樣品93份。陰性樣品30個，為gG缺失苗免疫的試驗豬血清，來自陰性豬場，該試驗豬沒有自然感染偽狂犬病毒野毒，也沒有進行非gG缺失苗免疫；弱陽性樣品48個，為未免疫偽狂犬病毒疫苗，但具有非gG缺失苗母源抗體的試驗豬血清，來自陽性豬場；陽性樣品15個，為非gG缺失疫苗免疫過的豬血清，來自陽性豬場。93份樣品檢測后進行符合率計算。根據(jù)試驗豬血清的不同來源及豬場的情況，檢測結果與預期的結果一致，符合率100%。檢測結果及符合率見表1。

表1 血清樣品檢測結果Tab.1 The test result of serum samples

3 討 論

偽狂犬病自1947年在中國發(fā)現(xiàn)首例以來，已在中國流行70年[8]。偽狂犬病依舊是威脅中國養(yǎng)豬業(yè)的重要豬病之一，加強科學飼養(yǎng)指導，制定合理的免疫程序，加強偽狂犬病毒抗體檢測，是防控偽狂犬病，凈化豬場的重要防控措施[5]。目前，針對偽狂犬病毒的疫苗有滅活疫苗、自然弱毒疫苗、基因缺失疫苗等[9]。由于滅活疫苗存在免疫效果不佳，接種劑量大的缺點，天然弱毒疫苗存在TK基因，毒力返強的可能性大，可能造成接種豬免疫抑制等，逐漸被基因缺失疫苗所取代[10-11]?；蛉笔б呙缫匀笔K基因作為基礎，有單基因缺失、雙基因缺失及多基因缺失疫苗，中國較為常用的基因缺失疫苗有TK-/gG-、TK-/gE-及TK-/gC-等雙基因缺失疫苗[9]。TK-/gG-疫苗株是利用一株碘脫氧尿感抗性突變株HR(TK-)作為親本構建的一種雙基因缺失疫苗株[12]，其缺失gG基因，不會表達gG蛋白，因此通過檢測血清中gG蛋白抗體即可鑒別野毒感染豬和疫苗免疫接種豬。

目前，研究者以檢測gE蛋白抗體的ELISA試劑盒作為研究關注的重點[3,13-14]。對于接種TK-/gG-雙基因缺失疫苗的養(yǎng)殖場缺乏便捷的檢測方法，不利于偽狂犬病的防控。該研究通過構建偽狂犬病毒gG部分基因原核表達載體pET-32a-gG，通過加入1 mmol/L的IPTG，在30 ℃時，成功誘導表達出偽狂犬病毒gG蛋白片段，利用該蛋白作為包被蛋白，研發(fā)出檢測gG抗體的gG-ELISA檢測方法，檢測已知豬場血清93份，其中陽性血清63份，陰性血清30份，符合率為100%。該gG-ELISA檢測方法為偽狂犬病的檢測帶來便利，填補市場上沒有針對TK-/gG-疫苗的檢測方法的空缺，有利于偽狂犬病的防控。為徹底凈化豬偽狂犬病提供技術上的支撐。