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    堆型艾美耳球蟲外分泌蛋白致細(xì)胞損傷研究

    2021-01-08 05:37:22王黎霞張建軍
    關(guān)鍵詞:外分泌傳代弓形蟲

    王黎霞,黃 芳,張建軍,安 健*

    (1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系;北京 102442;2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

    原蟲的分泌蛋白是蟲體在黏附、入侵宿主細(xì)胞及在帶蟲空泡內(nèi)分泌的,惡性瘧原蟲的分泌蛋白與整蟲的免疫原性存在差異[1]。弓形蟲速殖子微線和棒狀體從頂端分泌蛋白,而致密顆粒從蟲體頂端、側(cè)面及后面分泌蛋白[2]。弓形蟲頂端識別宿主細(xì)胞后,啟動信號,使蟲體內(nèi)的鈣離子水平升高,刺激微線分泌相關(guān)蛋白[3],使蟲體黏附、入侵宿主細(xì)胞[4],隨之棒狀體和致密顆粒分泌蛋白形成帶蟲空泡,構(gòu)成空泡內(nèi)微絨毛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成分[5],促進(jìn)弓形蟲的發(fā)育和分化[6];外分泌蛋白免疫,增強IL-12、IL-10表達(dá),使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性降低,影響弓形蟲的入侵和發(fā)育[7],保護(hù)宿主細(xì)胞[8],提高小鼠的保護(hù)力[9];外分泌蛋白也是鑒定感染的重要依據(jù)[10-11]。球蟲感染后,雞腸壁彈性喪失,黏膜脫落,黏膜層變薄,內(nèi)容物中40%~60%的水不被吸收,盡管雞大量飲水但仍然出現(xiàn)脫水癥狀,飼料利用率低,糞便變稀不成形,帶有大量黏液,雞糞便帶血,甚至出現(xiàn)死亡,證明雞球蟲入侵引起腸道上皮組織功能和器質(zhì)上的損傷[12],受細(xì)菌、病毒毒素致病性啟發(fā),筆者推測球蟲的外分泌蛋白的釋放對雞體也會產(chǎn)生損傷,而在艾美耳球蟲的研究中未見雞球蟲外分泌蛋白致病性的報道[13],該試驗通過牛腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)E.acervulina,SDS-PAGE和Western Blot鑒定雞球蟲外分泌蛋白,吖啶橙(OA)和碘化丙啶(PI)染色判定該蛋白對細(xì)胞的損傷性,初步研究外分泌蛋白的外毒素功能。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    E.acervulina、牛腎傳代細(xì)胞,北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)病理學(xué)實驗室保存;高糖DMEM、犢牛血清,Gibico公司產(chǎn)品;青霉素、胰酶,Orien公司產(chǎn)品;硫酸鏈霉素,Topbio公司產(chǎn)品。

    1.2 方 法

    1.2.1 雞抗E.acervulina血清制備 純化球蟲的子孢子[14],制備可溶性蛋白加等體積的弗氏完全佐劑,每只200 μL免疫12日齡無球蟲感染的雞,10 d后二免,二免后10 d,心臟采血,分離抗E.acervulina血清[15]。

    1.2.2E.acervulina外分泌蛋白分離 子孢子與細(xì)胞共培養(yǎng)2.5 h,使子孢子侵入細(xì)胞[16],換入無血清培養(yǎng)液,每隔12 h收集該時間點前12 h的培養(yǎng)液,并換新培養(yǎng)液,至60 h。離心收集培養(yǎng)液上清[17],透析濃縮,SDS-PAGE、銀染確定外分泌蛋白的大小及分泌時間,抗球蟲血清為一抗,HRP-兔抗雞抗體為二抗,Western Blot確定外分泌蛋白的來源。

    1.2.3E.acervulina外分泌蛋白的細(xì)胞損傷 牛腎傳代細(xì)胞接種到6孔板,每孔100萬細(xì)胞,培養(yǎng)2 h,換入新培養(yǎng)液對照組,保持培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組,加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組,繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h,吖啶橙和碘化丙啶染色鑒定細(xì)胞膜和核膜的損傷。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同培養(yǎng)時間的E. acervulina外分泌蛋白SDS-PAGE分析

    12~24 h蛋白的條帶最清晰,24~36 h蛋白條帶變暗,36~48 h幾乎看不到蛋白帶,0~12 h和48~60 h看不到外分泌蛋白,表明隨著子孢子的發(fā)育,E.acervulina外分泌蛋白的量不斷減少,見圖1。

    2.2 E. acervulina外分泌蛋白的Western Blot鑒定

    Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)1條清晰的70 kD反應(yīng)條帶與抗E.acervulina血清反應(yīng)(圖2),說明該蛋白是E.acervulina分泌的。

    2.3 E. acervulina外分泌蛋白對牛腎傳代細(xì)胞的損傷

    新培養(yǎng)液對照組、培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組和加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組在自然光和吖啶橙染色綠色熒光下未發(fā)現(xiàn)差異(圖3A、3D、3G和圖3B、3E、3H),說明細(xì)胞的遺傳物質(zhì)沒有受到損傷;在碘化丙啶染色紅色熒光下,新培養(yǎng)液對照組與培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組比較沒有區(qū)別,說明培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組對細(xì)胞膜和核膜沒有損傷(圖3C、3F),加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組與新培養(yǎng)液對照組和培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組三者比較,加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組的細(xì)胞,在細(xì)胞形態(tài)上未見改變,碘化丙啶染色紅色熒光細(xì)胞明顯增多(圖3C、3F、3I),說明加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組細(xì)胞膜和核膜有損傷。

    3 討 論

    為了分離E.acervulina的外分泌蛋白,該試驗利用無血清培養(yǎng),避免培養(yǎng)液中血清蛋白對于試驗結(jié)果的干擾。每間隔12 h收集該時間點前12 h的培養(yǎng)液,濃縮后SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)60 h內(nèi)12~24 h的E.acervulina外分泌蛋白最多,Western Blot鑒定該蛋白約70 kD,該外分泌蛋白是子孢子發(fā)育成為第一代裂殖子過程中向細(xì)胞外分泌的。

    巨噬細(xì)胞游走抑制因子和天冬氨酰轉(zhuǎn)移酶是E.acervulina外分泌蛋白,前者裂殖子期分泌[18],后者在子孢子的折光體中[19],與柔嫩艾美耳球蟲有97.4%相似度[20],入侵時分泌。弓形蟲在入侵時分泌很多蛋白,如MIC系列、溶菌酶、醛縮酶、透明質(zhì)酸酶等[21],形成帶蟲空泡[22],滋養(yǎng)體分泌穿透-增強因子,促進(jìn)蟲體入侵[23]。柔嫩艾美耳球蟲子孢子分泌EtSAG10、EtMIC5和TA4[24]。該試驗分離得到的外分泌蛋白約70 kD,與已知蛋白大小有明顯差異,推測為一種未知蛋白。

    弓形蟲外分泌蛋白可提高弓形蟲的穿透能力和繁殖能力[13],說明外分泌蛋白對寄生細(xì)胞和非寄生細(xì)胞都有作用,作為信號而影響其他細(xì)胞。球蟲寄生的細(xì)胞核增大或者減小,細(xì)胞質(zhì)空泡化或呈現(xiàn)不規(guī)則,裂殖體成熟,裂殖子溢出細(xì)胞時,空泡化不僅在寄生細(xì)胞,臨近無寄生細(xì)胞也發(fā)生[25],預(yù)示球蟲外分泌蛋白的毒素作用。

    吖啶橙能透過完整細(xì)胞膜,用于鑒定雙鏈DNA損傷,與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)綠色熒光,與單鏈核酸結(jié)合發(fā)紅色熒光。碘化丙啶不能透過正常細(xì)胞膜和核膜,用于鑒定膜損傷,它與核酸結(jié)合發(fā)出紅色熒光[26]。該試驗中,新培養(yǎng)液對照組、培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組和加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組在自然光和吖啶橙染色綠色熒光下無差異,說明細(xì)胞核酸沒有受損;在碘化丙啶染色紅色熒光下,新培養(yǎng)液對照組與培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組比較無差異,說明培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組細(xì)胞膜沒有受損,加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組與新培養(yǎng)液對照組和培養(yǎng)過牛腎傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液對照組三者比較,加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組的細(xì)胞,在細(xì)胞形態(tài)上改變不是很大,紅色熒光細(xì)胞明顯增多,說明加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組膜有損傷,它引起細(xì)胞膜、核膜的通透性增加。該蛋白可能與第一代裂殖子從細(xì)胞溢出、入侵新的宿主細(xì)胞有關(guān),同時,該外分泌蛋白具有球蟲外毒素的功能,也具備作為球蟲免疫的候選抗原的可能性,而該蛋白是否促進(jìn)裂殖子溢出、入侵新的細(xì)胞、是否有免疫原性及在雞體是否具有同樣作用需進(jìn)一步研究。

    該試驗通過牛腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)、SDS-PAGE和Western Blot發(fā)現(xiàn)一條70 kD的E.acervulina外分泌蛋白,在第一代裂殖體形成中分泌,它引起細(xì)胞膜和核膜的通透性增加,說明該E.acervulina外分泌蛋白具有球蟲外毒素的功能。

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