朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3基因克隆及表達特征分析

丁 超，宋莉紅，卜春亞

(北京農(nóng)學院生物與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)別名紅蜘蛛，俗稱“紅蛐”，屬于蜱螨目葉螨科，為多食性害螨，主要寄主是瓜類、豆類等植物，廣泛分布于中國各地[1]。因其具有較強的繁殖能力且近親交配、生存領域小、世代周期短、對環(huán)境適應性強、且時常接觸殺蟲劑，導致其產(chǎn)生抗藥性比其他農(nóng)作物害蟲更為嚴重[2]。目前全球市面上最主流的防治方法是依靠化學農(nóng)藥進行化學防治，其具有見效快、成本低、面積廣等優(yōu)點，常用的有炔螨特、阿維菌素、氟蟲脲、噠螨靈、吡蟲啉等[1]；該方法有一定的缺點，如易殘留、毒性大，對人體產(chǎn)生危害，噴灑的同時對周圍環(huán)境產(chǎn)生破壞。同時由于朱砂葉螨等害蟲具有易產(chǎn)生抗藥性的特點，極易造成后期難以殺死，需要加大農(nóng)藥的劑量，從而造成惡性循環(huán)。

幾丁質(zhì)脫乙酰基酶(CDA)是參與昆蟲幾丁質(zhì)代謝的關鍵酶類，其主要作用是將幾丁質(zhì)脫乙?；纬蓺ぞ厶牵@種修飾可能有助于增強多種蛋白與幾丁質(zhì)特異性結合的親和力[3]。幾丁質(zhì)是昆蟲生長發(fā)育過程中不可或缺的多糖，對昆蟲的外骨骼、表皮、圍食膜的形成起到重要作用。幾丁質(zhì)脫乙酰基酶在昆蟲的蛻皮和圍食膜的形成過程中起到關鍵作用[4-6]。

自1984年初次在魯氏毛霉(Mucorroxianus)的提取物中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)脫乙酰基酶以來，人們又陸續(xù)在昆蟲、真菌、細菌中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)脫乙?；傅拇嬖赱7-10]。Guo等[11]在2005年首次在昆蟲粉紋夜蛾的中腸中發(fā)現(xiàn)并鑒定其幾丁質(zhì)脫乙?；?，發(fā)現(xiàn)其在沒有幾丁質(zhì)結合區(qū)域的情況下有很強的幾丁質(zhì)結合活性并與圍食膜的特性相關。后來，Arakane等[12]在赤擬谷盜中發(fā)現(xiàn)多種幾丁質(zhì)脫乙?；福ㄟ^對其性質(zhì)和結構劃分出詳細的幾丁質(zhì)脫乙?；讣易?GroupⅠ-GroupⅤ)，GroupⅠ、GroupⅡ有3個保守區(qū)，GroupⅢ、GroupⅣ有幾丁質(zhì)結合結構域和乙?；呋Y構域，GroupⅤ只具有乙?；呋Y構域[13]。并通過RNAi的手段驗證部分幾丁質(zhì)脫乙?；笇ハx生長發(fā)育的影響。

目前研究表明哺乳動物和高等植物中并沒有幾丁質(zhì)脫乙?；?，故而可以利用幾丁質(zhì)代謝相關生物防治藥物去調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育和繁殖，從而達到防治害螨的目的，且對環(huán)境和人類的副作用小，符合綠色農(nóng)業(yè)的理念。該研究旨在克隆朱砂葉螨TecCDA3基因并分析其表達特征，為闡明朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；讣易宓於▓詫嵒A。

1 材料與方法

1.1 供試用昆蟲與試劑

供試用昆蟲為北京農(nóng)學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室培養(yǎng)的敏感品系朱砂葉螨，通過人工種植的白花蕓豆進行飼養(yǎng)，未經(jīng)任何特殊處理，溫度26 ℃±1 ℃，相對濕度50%±10%，光照/黑暗為16 h/8 h，此為朱砂葉螨的最適生長環(huán)境。EasyPure?RNA Kit、TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix、M5 HiPer pTOPO-Blunt Cloning Kit、M5 HiPer Top10 Competent Cell購自北京聚合美生物科技有限公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)購自大連寶生物(Takara)公司。

1.2 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3基因克隆

1.2.1 朱砂葉螨的培養(yǎng) 朱砂葉螨有4個生長時期，分別為卵時期、幼螨時期、若螨時期、成螨時期。用細毛刷挑取約1 000頭生長狀況良好的朱砂葉螨雌成螨到一盆新白蕓豆葉上，將其放回養(yǎng)螨室進行為期24 h的產(chǎn)卵，使用體式顯微鏡觀察產(chǎn)卵數(shù)量，若產(chǎn)卵數(shù)量較多且密集則將葉片上的雌成螨盡數(shù)挑下，使之只剩卵于其葉上，繼續(xù)觀察，約3 d朱砂葉螨由卵發(fā)育至幼螨，約5 d發(fā)育至若螨，約9～10 d發(fā)育至成螨。不同時期的螨均通過自然發(fā)育得到。將同一時間段所有螨均用細毛刷挑至0.02%的吐溫20溶液中進行細分，卵與幼螨使用0.175 mm篩子篩得幼螨，幼螨與若螨使用0.225 mm篩子篩得若螨，若螨與成螨使用0.3 mm篩子篩得成螨。過篩后用清水輕輕沖凈螨身上的吐溫溶液，將篩子倒扣于干燥的干凈吸水紙上吸干水分，通風干燥約2 min，待螨可以活動后用細毛刷收集最少10 mg同一時期的螨至1.5 mL離心管中，4個時期共計4個離心管。

1.2.2 朱砂葉螨總RNA提取 將1.2.1中的4個離心管快速置于液氮中，急速降溫約30 s，用電動研磨器將組織研磨成粉末，參照EasyPure?RNA Kit說明書對朱砂葉螨進行總RNA提取。

1.2.3 第一鏈cDNA合成 參照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書對朱砂葉螨總RNA進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.2.4 引物設計 根據(jù)前期獲得的朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過NCBI的Blast找到高同源性物種二斑葉螨，以其幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因為參照，設計5′引物和3′引物進行同源克隆，TecCDA3-F為5′-AATCACCACTGAATTTAGCCAAT-3′，TecCDA3-R為5′-TTGGTCAAAAGTGAGATTACTTG-3′。

1.2.5 基因擴增 以朱砂葉螨cDNA為模板進行PCR擴增(50 μL)，體系參照X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix說明書。PCR擴增程序為預變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，10 s；退火54 ℃，15 s；延伸72 ℃，1 min；34個循環(huán)；大延伸72 ℃，5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗，對符合大小的產(chǎn)物進行純化，純化后連接至TOPO載體上，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細胞中，菌液PCR進行驗證，對陽性克隆進行質(zhì)粒提取并送交上海生工生物公司進行測序。

1.3 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙酰基酶TecCDA3基因特征分析

通過NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/analyze)進行基因開放閱讀框的推導；將朱砂葉螨CDA的CDS區(qū)域翻譯成氨基酸序列后，通過NCBI的Blast工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)軟件進行氨基酸序列同源性比對，使用MEGA7.0系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，使用ML法進行發(fā)育樹構建，使用Bootstrap=200的方法進行結果數(shù)據(jù)的計算；通過SMART(https://smart.embl-heidelberg.de)進行蛋白功能域的預測；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)進行蛋白疏水區(qū)的分析。

1.4 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙酰基酶TecCDA3在不同生長時期的表達規(guī)律

1.4.1 不同生長時期朱砂葉螨的RNA提取和cDNA合成 使用全式金EasyPure?RNA Kit試劑盒分別對各個時期的朱砂葉螨進行RNA提取，然后通過全式金TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒以提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.2 實時熒光定量PCR 用Beacon Designer 7軟件設計TecCDA3基因的RT-qPCR引物，同時設計一對β-actin基因為內(nèi)參，引物見表1。

表1 TecCDA3熒光定量引物設計Tab.1 Design of RT-qPCR primers for TecCDA3

分別以朱砂葉螨4個時期的cDNA為模板，參照Takara公司的TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)說明書對熒光定量體系進行配置，PCR反應條件為二步法PCR。95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。單次試驗中每個樣本設置3次重復，同時設置陰性對照，陰性對照重復2次。程序設置使用相對定量△△Ct法，CT值使用2-△△Ct法計算其相對表達量，設定EGG時期為參照，相對表達量為1，使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著差異性分析，采用單因素方差分析(ANOVA)并采用Tukey's HSD算法進行分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3基因克隆

以朱砂葉螨cDNA為模板擴增得到與預期大小相一致的基因，大小約為1.6 kb。通過NCBI的ORF Finder工具分析TecCDA3的開放閱讀框，見圖1。TecCDA3包含一個長度為1 611 bp的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，共編碼536個氨基酸，以5′端的起始密碼子ATG開始編碼蛋白，TAA為其終止密碼子，蛋白分子量為62.07 kD。命名為TecCDA3(Genbank：MK779705)。

2.2 TecCDA3氨基酸序列同源比對分析

使用NCBI的Blast工具進行篩選，得到多組高同源性物種的氨基酸序列，用MEGA7.0軟件對二斑葉螨(Tetranychusurticae)、赤擬谷盜(Pseudostellacrassipes)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的CDA3氨基酸序列與朱砂葉螨TecCDA3進行同源比較，得到圖2。比對結果顯示朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；概c二斑葉螨具有最高的同源性；使用SMART在線工具對朱砂葉螨TecCDA3的氨基酸序列進行蛋白結構域分析，TecCDA3含有幾丁質(zhì)結合結構域(ChBD)，低密度脂蛋白受體結合結構域(LDLa)和多糖多乙酰基催化結構域(Polysaccharide deacetylase)。Group Ⅱ型幾丁質(zhì)脫乙?；妇羞@3種催化結構域，并且呈現(xiàn)高度的保守性。TecCDA3蛋白從第12個氨基酸到第31個氨基酸之間有明顯跨膜結構，共計20個氨基酸，表明其為跨膜蛋白，但是其并不含有信號肽位點。

2.3 TecCDA3的疏水性分析

通過ProtScale在線軟件在線對朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的疏水性進行分析預測，結果如圖3。當Score>0的得分時表示該區(qū)域為疏水性，當Score<0的得分時表示該區(qū)域為親水性，得分絕對值越高表明相對的親疏水性越高。TecCDA3的氨基酸序列中均含有親水區(qū)域和疏水區(qū)域，且分布總體上來說較為均勻，但是可以明顯看出處于Score<0的得分區(qū)域要多于Score>0的得分區(qū)域，故而總體上來說屬于親水蛋白，計算平均疏水性為-0.403，與預測的結果一致，為親水性蛋白。

2.4 分子進化樹構建

發(fā)育樹主要選取包括朱砂葉螨在內(nèi)的多種物種的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶，如圖4。通過發(fā)育樹的構建可以看出，TecCDA3與同屬蜱螨目的二斑葉螨的幾丁質(zhì)脫乙?；赣H緣性最高，由于高度的序列相似性，其遺傳距離十分相近。命名為TecCDA3，除此之外可以看出朱砂葉螨的幾丁質(zhì)脫乙?；概c蜱螨目的物種親緣關系最近，如柑橘全爪螨(Panonychuscitri)、二斑葉螨(Tetranychusurticae)，它們處于同一條分支上；與黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)等相對遺傳距離較近；與家蠶(Bombyxmori)、中華稻蝗(Oxyachinensis)等相對遺傳距離較遠。通過構建的發(fā)育樹可以明顯看出幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因家族的分布，為GroupⅠ至GroupⅤ，其中TecCDA3屬于Group Ⅱ。

2.5 TecCDA3基因在朱砂葉螨不同生長時期的表達規(guī)律

將得到的數(shù)據(jù)通過2-△△Ct法計算朱砂葉螨在4個生長時期相對表達量，結果通過Origin軟件進行作圖，見圖5。朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；冈?個生長時期(卵時期、幼螨時期、若螨時期、成螨時期)的mRNA豐度的相對差異，該試驗使用的內(nèi)參基因為β-actin，其作為看家基因在細胞中的表達量較為穩(wěn)定。TecCDA3在朱砂葉螨各個生長時期均有表達，但是表達量之間具有顯著差異，TecCDA3在成螨時期表達量達到最高，在幼螨時期表達量最低，在卵時期的表達量要高于若螨時期，整體呈現(xiàn)出一種先下降后上升的表達趨勢。

3 討 論

目前在中華稻蝗(O.sinensis)、赤擬谷盜(T.castaneum)、意大利蜂(I.bee)、黑腹果蠅(D.melanogaster)、岡比亞瘧蚊(A.gambiae)、柑橘全爪螨(C.citris)、家蠶(B.mori)、云山卷葉蛾(S.budworm)、褐飛虱(Nilaparvatalugens)、柑橘木虱(D.citri)等多種昆蟲中均發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)脫乙?；浮Ｆ渲谐鄶M谷盜最高的含有9種亞型基因，但并不是所有昆蟲都具備全部的9種亞型基因。這9種亞型被分為5個家族，這5個家族中目前研究最多的是Group Ⅰ，該家族基因被證實具有參與昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)代謝的作用，影響昆蟲胚胎表皮的形成和氣管幾丁質(zhì)的排列[14]。對其余的4個家族目前研究較少。

幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3為親水性蛋白，具有一個跨膜結構，無信號肽。由于不具備信號肽可能造成無法引導蛋白到達細胞含不同膜結構的亞細胞器內(nèi)，導致其無法加工。發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中含有3種不同的結構域，分別為幾丁質(zhì)結合結構域(ChBD)、多糖多乙?；呋Y構域(Polysaccharide deacetylase)和低密度脂蛋白受體結合結構域(LDLa)，且具有高度的保守性。分子進化樹分析可知，朱砂葉螨與二斑葉螨的親緣性最高。根據(jù)幾丁質(zhì)脫乙酰基酶具備的3個保守區(qū)域數(shù)目以及同源比對結果將TecCDA3歸類為Group Ⅱ家族。目前的研究表明赤擬谷盜TcCDA3在成蟲的胸肌中特異性表達[13]。NlCDA3為褐飛虱的腸道特異性幾丁質(zhì)脫乙?；?，在褐飛虱的各個生長發(fā)育階段均有較高的表達[15]。柑橘木虱DcCDA3在其外表皮和3日齡若蟲中含量最高，且表達水平與20-hydroxyecdysone的催化有關[16]。該研究的TecCDA3與北京農(nóng)學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室先前研究的與控制蛻皮有關的TecCDA1和TecCDA2之間的表達量存在著顯著差異，TecCDA1和TecCDA2均在卵時期有最高或較高的表達量，而TecCDA3則在卵時期相對表達量較低，在成螨時期表達量最高，這可能暗示其功能上的差異，其對朱砂葉螨是否具有影響蛻皮功能還有待進一步探究。該試驗結果豐富朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；富蚣易?，為基于靶向殺蟲基因的篩選提供理論和實踐依據(jù)。