紫花苜蓿葉綠體基因組密碼子偏好性分析

喻鳳 韓明

摘 要：? 為分析紫花苜蓿葉綠體基因組密碼子偏好性的使用模式，該文以紫花苜蓿葉綠體基因組中篩選到的49條蛋白質(zhì)編碼序列為研究對(duì)象，利用CodonW、CUSP、CHIPS、SPSS等軟件對(duì)其密碼子的使用模式和偏好性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：（1）紫花苜蓿葉綠體基因的第3位密碼子的平均GC含量為26.44%，有效密碼子數(shù)（ENC）在40.6～51.41之間，多數(shù)密碼子的偏好性較弱。（2）相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）分析發(fā)現(xiàn)，RSCU>1 的密碼子數(shù)目有30個(gè)，以A、U結(jié)尾的有29個(gè)，說明了紫花苜蓿葉綠體基因組A或U出現(xiàn)的頻率較高。（3）中性分析發(fā)現(xiàn)，GC3與 GC12的相關(guān)性不顯著，表明密碼子偏性主要受自然選擇的影響;ENC-plot 分析發(fā)現(xiàn)一部分基因落在曲線的下方及周圍，表明突變也影響了部分密碼子偏性的形成。此外，有17個(gè)密碼子被鑒定為紫花苜蓿葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。紫花苜蓿葉綠體基因組的密碼子偏好性可能受自然選擇和突變的共同作用。該研究將為紫花苜蓿葉綠體基因工程的開展和目標(biāo)性狀的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 紫花苜蓿， 葉綠體基因組， 密碼子偏好性， 最優(yōu)密碼子

中圖分類號(hào)：? Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2021）12-2069-08

收稿日期：? 2020-08-11

基金項(xiàng)目：? 貴州師范大學(xué)2017年博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（GZNUD [2017]16） [Supported by Doctoral Foundation of Guizhou Normal University （GZNUD [2017]16）]。

作者簡介： 喻鳳（1988-），博士，講師，研究方向?yàn)橹参锛?xì)胞遺傳學(xué)，（E-mail）yufengcaocao@163.com。

通信作者

Analysis of codon usage bias in the chloroplast genome of alfalfa （Medicago sativa）

YU Feng*， HAN Ming

（ School of Life Sciences， Guizhou Normal University， Guiyang 550025， China ）

Abstract：? To character the codon usage patterns of chloroplast genome in alfalfa， forty-nine coding DNA sequences were analyzed using CodonW， CUSP， CHIPS and SPSS softwares. The results were as follows： （1） The average GC content at the 3rd codon position was 26.44% in the alfalfa chloroplast genome. The effective codon number （ENC） ranged from 40.6 to 51.41， indicating that codon bias was weak in the alfalfa chloroplast genome. （2） Thirty codons showed relative synonymous codon usage （RSCU） value greater than 1， including 29 codons ending with A and U， which suggested that the third codon position preferred A or U. （3） Neutrality analysis showed no significant correlation was observed between GC3 and GC12， suggesting natural selection mainly contributed to the codon usage bias. ENC-plot analysis showed that there were some genes with low ENC values lying below or near the expected curve， which indicated that mutation also affected the formation of codon usage bias. In addition， 17 codons were identified as optimal codons in alfalfa. We concluded that the codon usage bias of alfalfa is formed under effect of natural selection and mutational bias. This study will lay a good foundation for development of chloroplast genetic engineering and molecular breeding of alfalfa.

Key words： Medicago sativa， chloroplast genome， codon usage bias， optimal codons

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種多年生豆科牧草，由于其具有適口性好、蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點(diǎn)，享有“牧草之王”的美譽(yù)（楊青川和孫彥，2011）。其栽培范圍廣布世界各地，是一種備受關(guān)注的世界性優(yōu)質(zhì)牧草。李剛（2019）研究表明，以紫花苜蓿作為飼料飼養(yǎng)的畜禽，可以提高畜禽的生產(chǎn)繁殖、肉品質(zhì)以及機(jī)體的免疫力。近年來，隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，對(duì)優(yōu)質(zhì)牧草的需求量也日益增加。但是，我國紫花苜蓿等牧草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展相對(duì)滯后，產(chǎn)量不足以滿足我國市場需求，仍需進(jìn)口大量牧草。這使得紫花苜蓿在我國的種植面積不斷增加，然而，種植過程中田間病蟲害和雜草等問題卻時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致大幅減產(chǎn)和品質(zhì)下降，制約著我國苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展（邊佳輝等，2020）。傳統(tǒng)的育種方法在解決這些難題時(shí)收效甚微，而基因工程育種技術(shù)的應(yīng)用卻成功獲得了大量具有抗病蟲和抗除草劑等優(yōu)良品質(zhì)的作物材料（楊朝國等，2010;郭三堆等，2015）。由于紫花苜蓿為四倍體植物，遺傳背景復(fù)雜，與利用核基因工程相比，葉綠體基因工程則具有外源基因可以定點(diǎn)整合、基因拷貝數(shù)多、母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)（程霞英，2004;周菲等，2015;Jin & Daniell， 2015）。因此，利用葉綠體基因工程引入抗病、抗蟲、抗除草劑等基因到紫花苜蓿中對(duì)其進(jìn)行遺傳性狀改良，將對(duì)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

在葉綠體基因工程育種中，有一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是外源基因的表達(dá)。有研究表明外源基因的表達(dá)水平會(huì)受到物種密碼子偏好性的影響（Hershberg & Petrov， 2008;Plotkin & Kudla， 2011;Quax et al.， 2015）。對(duì)某一種生物體的密碼子偏好性使用模式進(jìn)行研究，根據(jù)該生物的最優(yōu)密碼子來設(shè)計(jì)外源基因表達(dá)載體，可以起到優(yōu)化外源基因在葉綠體基因組中表達(dá)的作用。因此，本文將分析紫花苜蓿葉綠體基因組密碼子偏好性的特征及其密碼子偏性的影響因素，并確定其最優(yōu)密碼子，為紫花苜蓿葉綠體基因工程的開展和目標(biāo)性狀的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 葉綠體基因組序列的獲得

完整的紫花苜蓿葉綠體基因組下載于NCBI數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號(hào)為KU321683.1）（Tao et al.， 2017），從該葉綠體基因組中共獲得75條編碼蛋白質(zhì)的基因序列。為了更加準(zhǔn)確分析密碼子偏好性，首先剔除小于300 bp的基因編碼序列，其次選擇起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA、TAG、TGA的基因編碼序列，最終一共獲得49條序列用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析（楊國鋒等，2015;劉慧等，2017）。

1.2 分析方法

1.2.1 相對(duì)同義密碼子使用度分析 使用CodonW軟件對(duì)篩選出的49條序列的相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage， RSCU）進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)RSCU值等于1，表示該密碼子使用無偏好性;RSCU值大于1，表示該密碼子的使用頻率比其他同義密碼子高，反之亦然（Sharp & Li， 1987）。

1.2.2 中性繪圖分析 為了分析有關(guān)密碼子偏好性的影響因素，利用MEGA 6軟件分別統(tǒng)計(jì)密碼子3個(gè)位置的GC含量，GC1、GC2和GC3分別表示為第一位、第二位和第三位密碼子的GC含量。GC3s表示同義密碼子第三位的GC含量，GC12則表示第一位和第二位密碼子的GC含量的平均值。中性繪圖分析時(shí)，以GC3為橫坐標(biāo)、GC12為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖。

1.2.3 ENC-plot繪圖分析 為了進(jìn)一步分析堿基組成對(duì)密碼子偏好性的影響，ENC-plot繪圖分析以GC3s為橫坐標(biāo)、有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制散點(diǎn)圖。繪圖中的ENC標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式為ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+（1-GC3s）2]（Wright， 1990）。

1.2.4 奇偶偏好（parity rule 2， PR2）分析 為了評(píng)估密碼子第三位堿基A與T或C與G之間的組成偏差是否對(duì)密碼子偏好性產(chǎn)生影響，對(duì)具有4個(gè)同義密碼子編碼的氨基酸的各密碼子第三位的堿基組成進(jìn)行作圖分析。計(jì)算每個(gè)基因A3/（A3+T3） 和G3/（G3+C3）后，分別以A3/（A3+T3） 和G3/（G3+C3）為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)作圖，平面圖中心表示A=T，同時(shí)G=C（Sueoka， 2001）。

1.2.5 最優(yōu)密碼子的確定 本文以ENC值為偏好性標(biāo)準(zhǔn)確定最優(yōu)密碼子。首先，將ENC值進(jìn)行排序;然后，從ENC值最高和最低的兩極各選10%的基因，分別建成高低偏性庫（低ENC值對(duì)應(yīng)高偏性庫），并分別計(jì)算RSCU值和高低兩庫的ΔRSCU;最后，選取兩庫ΔRSCU>0.08，且RSCU>1的密碼子定義為最優(yōu)密碼子（王鵬良等，2019）。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成分析

將紫花苜蓿葉綠體基因組中的49條編碼序列作為一個(gè)整體進(jìn)行堿基組成分析，結(jié)果表明其平均GC含量為37.20%，GC1、GC2、GC3含量分別為46.57%、38.59%和26.44%（表1）。由此可以看出密碼子不同位置的堿基組成的GC分布并不均勻，其中GC1含量最高，而GC3含量最低。

有效密碼子數(shù)測量的是某基因的密碼子偏好程度，理論上的取值范圍為21～60。當(dāng)某一個(gè)基因平均地使用每一個(gè)密碼子，則其有效密碼子數(shù)為60;當(dāng)某一個(gè)基因只使用每組同義密碼子中的一個(gè)，則其有效密碼子數(shù)為20。參考前人研究以ENC值為35作為偏性強(qiáng)弱的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)（Comeron & Aguadé， 1988）。本研究結(jié)果顯示，紫花苜蓿葉綠體基因組ENC取值范圍都在40.6以上，因此紫花苜蓿葉綠體基因密碼子偏性普遍較弱（表1）。

堿基組成和有效密碼子數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：GCall和GC1、GC2、GC3的相關(guān)性都達(dá)到了極顯著水平，并且第一位堿基組成和第二位堿基組成的相關(guān)性也達(dá)到了極顯著水平，但兩者與第三位堿基組成的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平（表2）。表明紫花苜蓿葉綠體編碼基因密碼子第一位和第二位堿基組成較相似，但與第三位堿基組成卻存在差異;而有效密碼子數(shù)僅與GC3的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，說明密碼子第三位上的堿基組成對(duì)紫花苜蓿葉綠體編碼基因的密碼子偏好性影響顯著。

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，GC12分布于0.321 8～0.532 4之間，GC3分布于0.198 4～0.334 6之間，幾乎各基因的坐標(biāo)點(diǎn)都未落在對(duì)角線上或沿著對(duì)角線分布。GC12和GC3的相關(guān)系數(shù)為0.113 3，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩者的相關(guān)性不顯著。回歸曲線斜率為0.181 2，表明GC12和GC3的相關(guān)性較弱。進(jìn)一步說明突變對(duì)密碼子偏性形成的影響較弱，其他因素（如選擇）可能對(duì)密碼子的偏好性形成影響較大。

2.3 ENC-plot繪圖分析

為了進(jìn)一步分析堿基組成對(duì)密碼子偏好性的影響， ENC-plot繪圖以有效密碼子數(shù)為縱坐標(biāo)，GC3s為橫坐標(biāo)，定位所有基因的坐標(biāo)系，同時(shí)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示大部分基因沿標(biāo)準(zhǔn)曲線分布或位于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近（圖2）。為了進(jìn)一步反映差異，根據(jù)ENCexp公式求出ENC的理論值，再根據(jù)公式ENCratio=（ENCexp-ENCobs）/ENCexp求算出ENC比值。在此基礎(chǔ)上分析所有參與研究基因的ENC頻數(shù)分布（表3）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，大多數(shù)基因的ENC比值分布在-0.05～0.15之間，該范圍內(nèi)實(shí)際ENC與期望ENC值相差較小。因此，這說明突變對(duì)紫花苜蓿葉綠體基因組的部分基因密碼子偏好性的形成影響較大。

2.4 PR2-plot分析

利用PR2-plot繪圖分析了紫花苜蓿葉綠體基因組中部分氨基酸家族中密碼子第三位堿基A與T、C與G之間的關(guān)系（圖3）。結(jié)果顯示，大部分基因分布在圖的右下方，表明密碼子第三位堿基T的使用頻率高于A，G的使用頻率高于C。如果密碼子使用模式僅受到突變的影響，則A和T、G和C的堿基使用頻率理論上應(yīng)該相等。但本研究的結(jié)果顯示A和T、G和C的使用存在不均衡，表明紫花苜蓿葉綠體密碼子的使用模式不僅只受到突變的影響，還可能受到其他因素，如選擇等的影響。

2.5 相對(duì)同義密碼子使用度分析

紫花苜蓿葉綠體基因組中各氨基酸的相對(duì)同義密碼子的使用度分析如表4所示，結(jié)果顯示共有30個(gè)密碼子的RSCU大于1。其中以U或A結(jié)尾的密碼子占比為96.67%，以U結(jié)尾的為13個(gè)，以A結(jié)尾的為16個(gè)，說明紫花苜蓿偏愛使用結(jié)尾為U和A的密碼子。

2.6 最優(yōu)密碼子的確定

本文根據(jù)ΔRSCU法確定最優(yōu)密碼子。首先將ENC值進(jìn)行排序，然后從ENC值最高和最低的兩極各選10%的基因，最后分別建成高低偏性庫，并分別計(jì)算RSCU值和高低兩庫的ΔRSCU（表5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩庫ΔRSCU>0.08的一共有27個(gè)高表達(dá)密碼子（表5中*標(biāo)明）。選取表5中的高表達(dá)密碼子和表4中的高頻密碼子相結(jié)合進(jìn)行分析，將其共有密碼子定義為最優(yōu)密碼子。最終確定了紫花苜蓿葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子17個(gè)（UGU、UUA、CCU、CCA、CAA、CGU、ACU、ACA、AAA、AGA、GUU、GUA、GCU、GAU、GAA、GGU和UAA），在這17個(gè)最優(yōu)密碼子中，全以A或U結(jié)尾，此結(jié)果與GCall和GC3的高A、T含量一致。

3 討論與結(jié)論

在長期進(jìn)化過程中，特定物種為了適應(yīng)自身的基因組環(huán)境，往往形成了一套具有偏好性的密碼子使用模式（李平等，2011）。密碼子的使用偏好性受到基因組大小、CpG島、GC分布的位置、基因密度、基因序列長度、基因表達(dá)水平、tRNA豐度、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及密碼子變異偏好性等多種因素影響（Hanson & Coller， 2018;Paul et al.， 2018）。其中，自然選擇和突變是影響密碼子使用偏性的兩個(gè)主要因素，也是目前備受關(guān)注的兩個(gè)因素（Sharp et al.， 2010;Rao et al.， 2011;石元豹等，2018）。由于密碼子第三位堿基突變通常受到的選擇壓較第一位、第二位上的堿基小，因此，分析密碼子第三位堿基的堿基組成對(duì)密碼子的使用模式研究具有重要意義（原曉龍等，2021）。本研究表明紫花苜蓿葉綠體基因組各基因第三位密碼子堿基富含A和T，與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）（楊國鋒等，2015）、酸棗（Ziziphus jujuba var. spinosa）（胡曉艷等，2019）和蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana）（續(xù)晨等，2010）等植物葉綠體基因組第三位密碼子使用偏性相似，表明這類植物的葉綠體基因組密碼子使用模式具有高度相似性。這提示我們高等植物葉綠體基因組可能含有較高的A、T堿基含量，且密碼子使用模式的偏好性在進(jìn)化上存在一定的保守性。

紫花苜蓿的葉綠體基因組編碼基因的ENC值都大于40.6，說明紫花苜?；蚪M存在較弱的密碼子偏性。中性繪圖分析結(jié)果表明紫花苜蓿葉綠體基因組密碼子GC12與GC3相關(guān)性不顯著，表明密碼子的使用偏性可能更多受到選擇的影響;而ENC-plot繪圖分析表明突變是部分基因密碼子偏好性形成的重要因素;PR2-plot分析的結(jié)果則進(jìn)一步顯示密碼子的偏好性不僅受到突變的影響還受到選擇的影響。因此，在長期的進(jìn)化過程中，紫花苜蓿葉綠體基因組密碼子的使用偏性更多地受到選擇的影響，而突變也是部分基因的密碼子偏性形成的重要因素。這與前人對(duì)劍麻（Agave hybrid）（金剛等，2018）、糜子（Panicum miliaceum）（劉慧等，2017）和梧桐屬植物（陸奇豐等，2020）的葉綠體基因組密碼子偏性影響因素分析結(jié)果相似，表明影響植物葉綠體基因組密碼子偏性的因素是綜合性的。但具體的影響機(jī)制還有待通過進(jìn)一步的深入研究來揭示。

本研究將高表達(dá)的高頻密碼子定義為最優(yōu)密碼子，在紫花苜蓿葉綠體基因組中確定的17個(gè)最優(yōu)密碼子分別為UGU、UUA、CCU、CCA、CAA、CGU、ACU、ACA、AAA、AGA、GUU、GUA、GCU、

GAU、GAA、GGU和UAA。這些最優(yōu)密碼子都以A或U堿基結(jié)尾，這與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）（楊國鋒等，2015）、巨桉（Eucalyptus grandis）（王鵬良等，2019）、糜子（Panicum miliaceum）（劉慧等，2017）和籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus）（馮瑞云等，2019）等物種葉綠體基因組最優(yōu)密碼子分析結(jié)果一致。同時(shí)最優(yōu)密碼子的結(jié)果提示在紫花苜蓿的葉綠體基因工程的外源基因載體的設(shè)計(jì)時(shí)，選用這些A或U堿基結(jié)尾最優(yōu)密碼子或可提高外源基因的表達(dá)效率。

參考文獻(xiàn)：

BIAN JH， LIU ZY， LI ZY， et al.， 2020. Advances in alfalfa improvement using genetic engineering [J]. Pratac Sci， 37（1）： 139-155.? [邊佳輝， 劉自揚(yáng)， 李宗英， 等， 2020. 紫花苜?；蚬こ谈牧佳芯窟M(jìn)展 [J]. 草業(yè)科學(xué)， 37（1）：139-155.]

CHENG XY， 2004. Advances in the research of chloroplast genetic transformation [J]. Bull Biol， 39（3）： 15-17.? [程霞英， 2004. 葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 [J]. 生物學(xué)通報(bào)， 39（3）： 15-17.]

COMERON JM， MONTSERRAT A， 1998. An evaluation of measures of synonymous codon usage bias [J]. J Mol Evol， 47（3）： 268-274.

FENG RY， MEI C， WANG HJ， et al.， 2019. Analysis of codon usage in the chloroplast genome of grain amaranth （Amaranthus hypochondriacus L.） [J]. Chin J Grassl， 41（4）： 8-15.? [馮瑞云， 梅超， 王慧杰， 等， 2019. 籽粒莧葉綠體基因組密碼子偏好性分析 [J]. 中國草地學(xué)報(bào)， 41（4）： 8-15.]

GUO SD， WANG Y， SUN GQ， et al.， 2015. Twenty years of research and application of transgenic cotton in China [J]. Sci Agric Sin， 48（17）： 3372-3387.? [郭三堆， 王遠(yuǎn)， 孫國清， 等， 2015. 中國轉(zhuǎn)基因棉花研發(fā)應(yīng)用二十年 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 48（17）： 3372-3387.]

HANSON G， COLLER J， 2018. Codon optimality， bias and usage in translation and mRNA decay [J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 19（1）： 20-30.

HERSHBERG R， PETROV DA， 2008. Selection on codon bias [J]. Ann Rev Genet， 42（1）： 287-299.

HU XY， YU YQ， HAN YZ， et al.， 2019. Codon usage bias analysis of the chloroplast genome of Ziziphus jujuba var. spinosa [J]. J For Environ， 39（6）： 621-628.? [胡曉艷， 許艷秋， 韓有志， 等， 2019. 酸棗葉綠體基因組密碼子使用偏性分析 [J]. 森林與環(huán)境學(xué)報(bào)， 39（6）： 621-628.]

JIN G， TAN X， LONG LY， et al.， 2018. Characteristics of codon usage in the chloroplast protein-coding genes of Agave hybrid No. 11648 [J]. J Fujian Agric For Univ（Nat Sci Ed）， 47（6）： 705-710.? [金剛， 譚旭， 龍凌云， 等， 2018. 劍麻葉綠體基因組編碼序列密碼子的使用特征 [J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 47（6）： 705-710.]

JIN S， DANIELL H， 2015. The engineered chloroplast genome just got smarter [J]. Trends in Plant Sci， 20（10）： 622-640.

LI G， 2019. Research progress in Medicago sativa L. [J]. Anhui Agric Sci Bull， 25（14）： 71-75.? [李剛， 2019. 紫花苜蓿研究進(jìn)展 [J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)， 25（14）： 71-75.]

LI P， BAI YF， FENG RY， 2011. Analysis of codon bias of NAD-ME gene in Amaranthus hypochondriacus? [J]. J Appl Environ Biol， 17（1）： 12-17.? [李平， 白云鳳， 馮瑞云， 2011. 籽粒莧蘋果酸酶（NAD-ME）基因密碼子偏好性分析 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 17（1）： 12-17.]

LIU H， WANG MX， YUE WJ， et al.， 2017. Analysis of codon usage in the chloroplast genome of broomcorn millet （Panicum miliaceum L.） [J]. Plant Sci J， 35（3）： 362-371.? [劉慧， 王夢(mèng)醒， 岳文杰， 等， 2017. 糜子葉綠體基因組密碼子使用偏性的分析 [J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 35（3）： 362-371.]

LU QF， LUO WH， HUANG ZH， 2020.Codon usage bias of chloroplast genome from two species of Firmiana Marsili [J]. Guihaia， 40（2）： 173-183.? [陸奇豐， 駱文華， 黃至歡， 2020. 兩種梧桐葉綠體基因組密碼子使用偏性分析 [J]. 廣西植物， 40（2）： 173-183.]

RAO YS， WU GZ， WANG ZF， et al.， 2011. Mutation bias is the driving force of codon usage in the Gallus gallus genome [J]. DNA Res， 18（6）： 499-512.

PAUL P， MALAKAR AK， CHAKRABORTY S， 2018. Codon usage and amino acid usage influence genes expression level [J]. Genetica， 146（1）： 53-63.

PLOTKIN JB， KUDLA G， 2011. Synonymous but not the same： the causes and consequences of codon bias [J]. Nat Rev Genet， 12（1）： 32-42.

QUAX TE， CLAASSENS NJ， SOELL D， et al.， 2015. Codon bias as a means to fine-tune gene expression ?[J]. Mol Cell， 59 （2）： 149 -161.

SHARP PM， EMERY LR， ZENG K， 2010. Forces that influence the evolution of codon bias [J]. Phil Trans Roy Soc London B， 365（1544）： 1203-1212.

SHARP PM， LI WH， 1987. The codon adaptation index—a measure of directional synonymous codon usage bias， and its potential applications [J]. Nucl Acid Res， 15（3）： 1281-1295.

SHI YB， WANG GB， YANG XM， et al.， 2018. Analysis of codon usage bias of gene factors in Ginkgo biloba WRKY family [J]. Mol Plant Breed， 17（5）： 1503-1511.? [石元豹， 汪貴斌， 楊曉明， 等， 2018. 銀杏WRKY家族基因密碼子使用偏向性分析 [J]. 分子植物育種， 17（5）： 1503-1511.]

SUEOKA N， 2001. Near homogeneity of PR2-bias fingerprints in the human genome and their implications in phylogenetic analyses [J]. J Mol Evol， 53（4-5）： 469-476.

TAO XL， MA LC， ZHANG ZS， et al.， 2017. Characterization of the complete chloroplast genome of alfalfa （Medicago sativa） （Leguminosae） [J]. Gene Reports， 6： 67-73.

WANG PL， WU SC， YANG LP， et al.， 2019. Analysis of codon bias of chloroplast genome in Eucalyptus grandis [J]. Guihaia， 39（12）： 1583-1592.? [王鵬良， 吳雙成， 楊利平， 等， 2019. 巨桉葉綠體基因組密碼子偏好性分析 [J]. 廣西植物， 39（12）： 1583-1592.]

WRIGHT F， 1990. The‘effective number of codons’ used in a gene [J]. Gene， 87（1）： 23-29.

XU C， BEN AL， CAI XN， 2010. Analysis of synonymous codon usage in chloroplast genome of Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana [J]. Mol Plant Breed， 8（5）： 945-950.? [續(xù)晨， 賁愛玲， 蔡曉寧， 2010. 蝴蝶蘭葉綠體基因組密碼子使用的相關(guān)分析 [J]. 分子植物育種， 8（5）： 945-950.]

YANG CG， YANG FF， ZHANG DF， 2010. Methods of screening transgenic maize with herbicide glufosinate resistance [J]. Crops， 269（6）： 32-35.? [楊朝國， 楊方方， 張登峰， 2010. 抗除草劑草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米后代篩選方法的研究 [J]. 作物雜志， 269（6）： 32-35.]

YANG GF， SU KL， ZHAO YR， et al.， 2015. Analysis of codon usage in the chloroplast genome of Medicago truncatula [J]. Acta Pratac Sin， 24（12）： 171-179.? [楊國鋒， 蘇昆龍， 趙怡然， 等， 2015. 蒺藜苜蓿葉綠體密碼子偏好性分析 [J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 24（12）： 171-179.]

YANG QC， SUN Y， 2011. The history， current situation and development of alfalfa breeding in China [J]. Chin J Grassl， 33（6）： 95-101.? [楊青川， 孫彥， 2011. 中國苜蓿育種的歷史、現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì) [J]. 中國草地學(xué)報(bào)， 33（6）： 95-101.]

YUAN XL， LI YQ， ZHANG JF， et al.， 2021. Analysis of codon usage bias in the chloroplast genome of Dalbergia odorifera [J]. Guihaia， 41（4）： 622-630.? [原曉龍， 李云琴， 張勁峰， 等， 2021. 降香黃檀葉綠體基因組密碼子偏好性分析 [J]. 廣西植物， 41（4）： 622-630.]

ZHOU F， LU SZ， GAO L， et al.， 2015. Plastid genome engineering： novel optimization strategies and applications [J]. Hereditas， 37（8）： 777-792.? [周菲， 路史展， 高亮， 等， 2015. 植物質(zhì)體基因工程：新的優(yōu)化策略及應(yīng)用 [J]. 遺傳， 37（8）： 777-792.]

（責(zé)任編輯 周翠鳴）