CircRNA進展

湯博藝

（西藏大學理學院，西藏拉薩 850012）

1976年，Sanger等[1]提出一種“共價閉合環(huán)狀單鏈RNA”的類病毒，這是人類首次證明環(huán)狀RNA（Circular RNAs，CircRNA）的存在。隨后人們相繼在酵母細胞、小鼠睪丸、人體成纖維細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)CircRNA。自90年代末起，更多的CircRNA證明與人類的細胞色素P450基因、人類抗營養(yǎng)不良基因、人類細胞周期蛋白依賴性激酶4（INK4/ARF）等基因有關(guān)。這些早期的研究清楚地證明了環(huán)狀RNA分子的存在，但其潛在價值尚未發(fā)掘。

自2010年起，隨著RNA測序技術(shù)和生物信息學技術(shù)的進步，關(guān)于CircRNA的研究開始高速發(fā)展。使用RNase R（一種來源于大腸桿菌RNR超家族的3'～5'核糖核酸外切酶）[2]預處理，分析無聚腺苷酸富集的CircRNA文庫，不僅可以富集CircRNA，還可以將真實的CircRNA與帶有折疊錯誤的mRNA區(qū)分開來。目前，多項研究揭示了CircRNA在人類、小鼠和果蠅中以組織和發(fā)育階段特異性的方式進行表達，并與免疫應答、癌癥發(fā)生等生理病理過程相關(guān)，可以作為疾病診斷的生物靶標。

1 CircRNA的分子結(jié)構(gòu)

CircRNA不具5'末端帽和3'末端poly（A）尾，是一類共價環(huán)狀內(nèi)源ncRNA，主要具有以下特征：（1）在真核生物的組織細胞中表達相當豐富，且表達具有組織特異性和時空選擇性，CircRNA在某些人體組織中的分子總量甚至達線性RNA的10倍以上；（2）CircRNA對核酸酶具有抗性，穩(wěn)定性較ncRNA更強，并且大多CircRNA的進化十分保守；（3）CircRNA通常包含完整的外顯子，位于細胞質(zhì)中，只有少數(shù)CircRNA由內(nèi)含子環(huán)化而成，位于細胞核中。

2 CircRNA的生物起源

CircRNA由前體mRNA（pre-mRNA）產(chǎn)生，并由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄。目前，發(fā)現(xiàn)的CircRNA可以根據(jù)其不同的組成和循環(huán)機制簡單地分為3種類型：外顯子CircRNA（EcircRNA）、內(nèi)含子CircRNA（CiRNA）和外顯子-內(nèi)含子CircRNA（EIciRNA）。

2.1 EcircRNA

EcircRNA通過外顯子的反向剪接形成。目前，有3種假設(shè)模型解釋EcircRNA的發(fā)生：外顯子跳讀、內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化和RNA結(jié)合蛋白（RBP）介導的環(huán)化。如圖1所示，在形成EcircRNA時，premRNA在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生部分折疊，外顯子隨RNA折疊而跳躍，形成“套索結(jié)構(gòu)”，在套索結(jié)構(gòu)內(nèi)通過剪接去除內(nèi)含子序列后形成CircRNA，這種方式稱為“外顯子跳讀”；由pre-mRNA兩側(cè)內(nèi)含子上的反向互補序列配對形成CircRNA稱為內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化；此外，一些RNA結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)在環(huán)狀RNA的形成中起關(guān)鍵作用[2]。ADAR1是一種RNA編輯修飾酶，不僅能編輯修飾RNA，還可以通過靶向定位人類細胞中的雙鏈Alu重復序列結(jié)合雙鏈RNA，從而具有RBP（視黃醇結(jié)合蛋白）功能，因此ADAR1可通過干擾RNA配對抑制CircRNA形成。DHX9是一種豐富的核RNA解旋酶，具有一個類似于ADAR的特殊結(jié)構(gòu)域。沉默DHX9通常通過解開環(huán)狀外顯子側(cè)面的RNA雙鏈來增加環(huán)狀RNA的產(chǎn)量。

2.2 CiRNA

多數(shù)內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)時迅速被去分支酶降解。然而，在Hela細胞和人胚胎干細胞中有一些包含位于5'端的GU重復序列和位于分支點的CC重復序列的內(nèi)含子能逃避去分支酶的降解，形成ciRNA。

2.3 EIciRNA

兩個以上的EcircRNA環(huán)化時，內(nèi)含子切除不完全可產(chǎn)生EIciRNA。EIciRNA主要位于細胞核中。

3 CircRNA功能

3.1 CircRNA充當microRNA海綿

CeRNA假說表明，microRNA可以結(jié)合在靶基因上，在轉(zhuǎn)錄后水平影響mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄；然而，microRNA自身又受到ceRNA的調(diào)控。許多CircRNA具有不同類型和數(shù)量的microRNA結(jié)合位點，從而具有microRNA海綿效應，降低microRNA活性并上調(diào)microRNA相關(guān)靶基因的表達，發(fā)揮高效ceRNA功能。例如，小腦退行性相關(guān)蛋白基因1（CDR1）的CircRNA分子（CDR1as-ciRS-7）有超過60個保守的miRNA-7結(jié)合位點。在人類和小鼠腦組織中，ciRS-7作為miR-7的分子海綿，抑制miRNA miR-7與靶基因CDR1的結(jié)合，進而正向調(diào)控miR-7靶基因。

圖1 Circ RNA的三種剪切方式

然而，特定CircRNA豐度（除了果蠅的MBL和人類的CDRIas）通常較低，這與經(jīng)典的CircRNA-microRNA海綿假說似乎相矛盾。因為microRNA的表達十分豐富，microRNA與靶基因的結(jié)合位點也遠比與CircRNA結(jié)合的位點更多，這大大降低了CircRNA與microRNA結(jié)合的可能性。因此CircRNA還可能發(fā)揮催化作用，直接激活、降解或滅活microRNAs，但此猜想尚無明顯證據(jù)。

3.2 CircRNA調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄

除充當MicroRNA海綿外，一些ciRNAs和EIciRNAs還可以通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的方式調(diào)控基因表達來調(diào)控蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。EIciRNAs可與U1小核核糖核蛋白（U1-small nuclear ribonucleo protein，snRNP）相互作用，通過與RNApolⅡ結(jié)合，促進親代基因轉(zhuǎn)錄。此外，一項研究發(fā)現(xiàn)，剪切因子MBL的第2個外顯子可發(fā)生環(huán)化，以CircMbⅠ的形式與premRNA通過線性剪切競爭，影響線性RNA的形成，調(diào)控相關(guān)基因的表達。

3.3 CircRNA與腫瘤相關(guān)

CircRNA對腫瘤具有抑制作用。Shang等[3]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005075的表達在肝癌組織和正常組織存在差異，其表達和腫瘤大小有密切關(guān)系，并展示出良好的診斷潛力。Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_002059作為一種典型的circRNA在胃癌組織中低表達，與胃癌轉(zhuǎn)移、TNM分期、性別和年齡等密切相關(guān)。因此，CircRNA有望作為一種新型的生物標志應用于腫瘤的診斷。

4 CircRNA研究面臨的挑戰(zhàn)

隨著測序技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，越來越多的CircRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)，成為RNA領(lǐng)域的研究熱點。然而，CircRNA的研究仍然面臨許多挑戰(zhàn)。（1）目前國際上對于CircRNA并沒有統(tǒng)一的命名約定，極易造成混淆。（2）目前，關(guān)于CircRNA的數(shù)據(jù)庫還不完善。雖然研究人員可以通過多個數(shù)據(jù)庫預測CircRNA的功能，但是還沒有與腫瘤預后相關(guān)的CircRNA數(shù)據(jù)庫，在RNA-seq后功能CircRNA的篩選方面面臨困難。

5 結(jié)語

CircRNA的發(fā)現(xiàn)豐富了人們對生物進化的認識，加深了對非編碼RNA家族的理解，為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的方向。雖然目前對于CircRNA在腫瘤中形成、轉(zhuǎn)運和功能的確切機制的認識還非常有限，但是隨著新技術(shù)的應用和科學家的不斷努力，相信與CircRNA有關(guān)的未知之謎終將被揭曉答案。