紅莓和黑莓葉黃酮類化合物抗氧化活性的比較研究

蔡成林，黃庭海，張青峰

（遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東珠海 519041）

我國樹莓資源豐富，根據(jù)果實(shí)成熟時(shí)的顏色，可以分為黑樹莓、黃樹莓和紅樹莓，果實(shí)中均含有黃酮類化合物，有著較強(qiáng)的抗氧化活性，無毒副作用，具有去除游離基、降低血壓、預(yù)防癌癥等明顯藥理效果。

本試驗(yàn)從紅莓葉和黑莓葉中提取具有抗氧化作用的黃酮類化合物，并通過吸收光度減弱的程度來評(píng)價(jià)自由基被消除的情況?？寡趸瘎┏ビ坞x基的作用愈好，代表抗氧化活性愈強(qiáng)。為了開發(fā)新的天然食品抗氧化劑，對(duì)它們的抗氧化活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海金穗生物科技有限公司；鹽酸，上海市氯堿化工股份有限公司；氫氧化鈉，廣州旭觀化工有限公司；亞硝酸鈉，武漢夢吉股份有限公司；硝酸鋁，太陽欣立上海分公司；無水乙醇，武漢市百利瑞化工有限公司；石油醚，浙江自貿(mào)易區(qū)正拓石油化工有限公司；雙氧水，山東瑞泰科技股份有限公司；鄰苯三酚，南京道斯夫科技有限公司；磷酸二氫鈉，濰坊市金海化工有限公司；鄰二氮菲，濟(jì)寧百川化工有限公司；羥基氨基甲烷，天津市大茂化學(xué)試劑廠；二丁基羥基甲苯（BHT），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（VC），浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BSA124S精密電子天平，深圳市林濤儀器有限公司；C-20玻璃儀器氣流烘干器，上海貝侖儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，上海霓玥儀器有限公司；HF-56數(shù)字恒溫水浴鍋，上海賀范儀器有限公司；7415紫外可見分光光度計(jì)，上海霓玥儀器有限公司；DFY-200C高速粉粹機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.3 黃酮化合物的提取

紅莓、黑莓葉粉碎后烘干，精密稱量獲取10 g，分別放在500 mL圓底燒瓶之中，加入400 mL濃度為75%的乙醇溶液，在75 ℃的水浴之中提取1.2 h后真空抽濾，濾液加水稀釋至100 mL。

1.4 黃酮含量的測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

精密稱量獲取蘆丁10 mg，加適量75%的乙醇，微熱使之溶解，置100 mL容量瓶中定容，搖勻后放至自然冷卻，得到標(biāo)準(zhǔn)蘆丁乙醇溶液。分別取溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL置于50 mL容量瓶中，加5% NaNO21 mL,搖勻，放置6 min；加10% AI(NO3)31 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH 8 mL，混勻，用75%乙醇稀釋至刻度，放置15 min后用紫外分光光度計(jì)在510 nm波長下測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。測得吸光度Y與濃度X的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=10.561X-0.001 8，R2=0.999 5。

1.4.2 黃酮總含量的測定方法

利用分光光度計(jì)測定總黃酮含量，分別獲取提取液各0.2 mL于50 mL容量瓶中，用75%乙醇補(bǔ)充至25 mL，加5%的NaNO21 mL，放置6 min；加10%AI(NO3)31 mL，搖勻，放置6 min；加 4% NaOH 8 mL，混勻，用75%乙醇稀釋至刻度，放置15 min后用紫外分光光度計(jì)在510 nm波長下測定吸光值。記錄吸光值在0～1.0以內(nèi)為有效。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮總含量。

1.5 抗氧化性的檢測

1.5.1 羥基自由基清除率測定

于6只試管中各加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液、2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，酸堿值7.4）和1 mL蒸餾水，充分混合均勻后加1 mL新配制的0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混合均勻；6支試管中依次加入新配制的0.01%雙氧水、蒸餾水、0.2 mg/mL的紅莓總黃酮提取液、0.2 mg/mL的黑莓總黃酮提取液、二丁基羥基甲苯、維生素C各1 mL；于37 ℃水浴加熱1 h后，在536 nm處測吸光度，分別記為A1（試管中加入雙氧水的吸光度）、A2（試管中加入蒸餾水的吸光度）、A3（紅莓和黑莓葉提取液的吸光度）、AVC（維生素C的吸光度）、ABHT（二丁基羥基甲苯的吸光度），每組重復(fù)3次，根據(jù)公式（1）計(jì)算清除率。改變紅莓總黃酮提取液、黑莓總黃酮提取液、二丁基羥基甲苯、維生素C的濃度（1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL），測定不同濃度下的清除率。

1.5.2 超氧自由基抑制率測定

將Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）和鄰苯三酚溶液（45 mmol/L）分別水?。?5 ℃）10 min，各取5 mL混合后搖晃均勻，于325 nm即刻測量吸光度（A0），隔0.5 min再測一次吸光度，計(jì)算鄰苯三酚的自氧化率，自氧化速度控制在0.060～0.065 min-1，常規(guī)以測量確定3.5 min平均計(jì)。增加試樣后氧化率測量方法：取5 mL Tris—HCl緩沖液（pH 8.2），加入待測試樣5～20 μL，50 mol/L鄰苯三酚溶液5 μL，搖晃均勻，即刻測定吸光度值（A），每組重復(fù)3次，根據(jù)公式（2）計(jì)算超氧自由基抑制率?？瞻坠転樗釅A值為8.2的Tris—HCl緩沖液。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅莓和黑莓提取液中黃酮總含量

如表1所示，紅莓、黑莓提取液黃酮總含量分別為14.2 mg/mL、18.6 mg/mL，且吸光度SD值表明實(shí)驗(yàn)隨機(jī)誤差較小，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好。

表1 紅莓、黑莓提取液吸光度值及黃酮總含量

2.2 羥基自由基清除率的測定結(jié)果

由圖2知，紅莓和黑莓提取物對(duì)羥游離基有一定的除去效果，低濃度時(shí)清除效果不顯著，高濃度時(shí)清除效果較強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)提取物濃度與清除率呈正相關(guān)；且羥基自由基清除率的大小為紅莓提取物＞黑莓提取物＞維生素C＞二丁基羥基甲苯。

圖2 黃酮類化合物清除羥基自由基能力的比較

2.3 超氧自由基清除率的測定結(jié)果

由圖3知，紅莓和黑莓提取物對(duì)鄰苯三酚自氧化形成的超氧負(fù)離子游離基有一定的除去效果。在一定范疇之內(nèi)，提取物濃度與清除率呈現(xiàn)正相關(guān)態(tài)勢。低濃度時(shí)，對(duì)鄰苯三酚自氧化的約束效果較弱，但在較高濃度時(shí)，其約束效果明顯。

圖3 黃酮類化合物清除超氧自由基能力的比較

黃酮類化合物通過酚羥基與游離基反應(yīng)產(chǎn)生較為平穩(wěn)的半醌式自由基構(gòu)造，使其具有抗氧化活性，羥基是否能產(chǎn)生較為平穩(wěn)的游離基構(gòu)造代表其抗氧化活性的強(qiáng)弱，決定其抗氧化活性的主要因素是B環(huán)上鄰二酚羥基的存在與否。2種莓葉提取液有著不一樣的抗氧化活性，是由酚羥基的代替區(qū)域所決定的。在2種黃酮提取物中以紅莓葉的黃酮類化合物除去游離基的效果最好，且在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

3 結(jié)論

紅莓葉中黃酮類化合物含量高，具有良好的抗氧化活性，是一種很好的非人工抗氧化活性物質(zhì)，可作為部分保健食品和化妝品的有效成分之一。該研究結(jié)果對(duì)促進(jìn)紅莓葉資源的開發(fā)與利用具有一定的參考價(jià)值。