水蛭抗凝血活性物質(zhì)分析及水蛭素提取純化的研究進(jìn)展

孫 雨 王宇維 劉錦瑜 于佳源 趙蔭騰 李繼紅

1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，張家口，075000，中國

2.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，張家口，075000，中國

中藥水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“水蛭，味咸平。主逐惡血淤血，月閉，破血瘕積聚，無子，利水道?！闭f明藥用水蛭具有破血、逐瘀等功效，經(jīng)研究表明其具有抗凝血、抗血栓、降脂、抗腫瘤、抗細(xì)胞凋亡、抗炎等作用［1］，可用于治療和預(yù)防各種心腦血管疾病、腫瘤、痛風(fēng)、腎病等。在水蛭體內(nèi)提取的水蛭素是一種酸性肽類化合物，是迄今世界上發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然凝血酶抑制劑。在臨床方面，水蛭素多用于治療彌漫性血管內(nèi)凝血（diffuse intravascular coagulation，DIC），不穩(wěn)定性心絞痛（unstable angina，USA），急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AM），連續(xù)性腎臟替代治療（continuous renal replacement therapy，CRRT）。國內(nèi)外醫(yī)療行業(yè)正試圖通過各種方式提取天然水蛭素，并將其開發(fā)成新一代高效特異性抗凝血、抗栓、抗腫瘤的藥物。

水蛭體內(nèi)含有多種抗凝血活性物質(zhì)，水蛭素是其中的一種。不同種類的水蛭含有不同的抗凝血有效成分，這極大影響了提取方法和條件的選擇。提取分離工作是開發(fā)利用水蛭素有效活性成分的基礎(chǔ)，使用不同方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會產(chǎn)生不同影響。因此本文綜述了幾種常見水蛭中含有的抗凝血活性物質(zhì)成分，并且對水蛭素的提取和純化方法進(jìn)行總結(jié)，旨在為高效快速提取水蛭素的方法的深入研究提供參考和借鑒。

1 不同品種水蛭抗凝血活性物質(zhì)分析

1.1 日本醫(yī)蛭（hirudo nipponica whitman）

日本醫(yī)蛭是吸血水蛭，軀體內(nèi)主要含水蛭素，但日本醫(yī)蛭體型小，水蛭素總含量較少。日本醫(yī)蛭軀體內(nèi)含有和水蛭素結(jié)構(gòu)相似，但是毫無抗凝血活性的偽水蛭素［2］。Markwardt 通過截取日本醫(yī)蛭的頭部或刺激唾液腺的方法提高了水蛭素純度，推測真正的水蛭素可能主要存在于其頭部或唾液腺中［3］。通過比較不同工藝條件對其抗凝血活性的影響，發(fā)現(xiàn)水蛭素受高溫影響會嚴(yán)重失活，因此需要嚴(yán)格低溫保存［4］。

1.2 寬體金線蛭（whitmania pigra）

寬體金線蛭屬于非吸血水蛭，主要以螺、蚌等軟體動物的體液為食。張彬等［5］曾認(rèn)為此種非吸血水蛭體內(nèi)可能不含水蛭素。近年來，程珊［6］采用 Native-PAGE與Western blot 結(jié)合的方法檢測到寬體金線蛭體內(nèi)含有與凝血酶結(jié)合的活性多肽，并且這種活性抗凝血多肽能與凝血酶形成不同比例穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體，此外寬體金線蛭中還含有與凝血因子FⅩa、FⅨa 結(jié)合的活性多肽。這說明寬體金線蛭體內(nèi)可能有非水蛭素類的抗凝血活性物質(zhì)。

1.3 菲牛蛭（philippine cattle leech）

菲牛蛭和日本醫(yī)蛭習(xí)性類似，主要以吸食人、畜血液為生。在菲牛蛭體內(nèi)除發(fā)現(xiàn)水蛭素外，還發(fā)現(xiàn)另一種抗凝血活性物質(zhì)—菲牛蛭素［7］，肖凌［8］對日本醫(yī)蛭和菲牛蛭的活性成分做了LC-MS 分析，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)構(gòu)大致相同，藥理學(xué)作用一致，但菲牛蛭素的抗凝血活性顯著高于水蛭素［9］。菲牛蛭體型大，體內(nèi)含有較多的菲牛蛭素［10］，且抗凝血活性并不會受人工養(yǎng)殖的影響［5］，未來這種水蛭可能是抗凝血活性物質(zhì)提取的主要原料。

2 提取方法

水蛭素的提取方法主要分為兩類，傳統(tǒng)提取法（水提法、鹽析沉淀法、有機(jī)溶劑提取法）和仿生誘導(dǎo)法，另外近些年來超聲法和酶解法也被用于嘗試提取水蛭素。

2.1 傳統(tǒng)提取方法

水提法是用0.9%的生理鹽水按四倍水蛭原液體積的比例進(jìn)行粗提，并用10%～15%的三氯乙酸除去大量雜蛋白［11］，這種方法較為簡便，成本低，能夠保證蛋白質(zhì)的活性，但是提取率很低。

鹽析沉淀法是利用35%～55%飽和度硫酸銨鹽［12］降低水蛭原液中蛋白質(zhì)的溶解度使之沉淀，以此達(dá)到粗提的目的，盡管蛋白質(zhì)的提取率不是很高，但水蛭素的活性較高。通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究確定利用40%飽和度硫酸銨將水蛭原液在pH 為5.5 的環(huán)境中靜置20 min后分離［13］，可以達(dá)到此方法的最高提取效率。

有機(jī)溶劑提取法就是利用醇、丙酮等作為提取溶劑。常用含水15 %的丙酮溶液（-20℃冰箱預(yù)冷）浸泡水蛭原液過夜，使得蛋白質(zhì)分子充分聚集，再通過離心保留聚沉的蛋白質(zhì)。這種方法具有較高的提取率，但是這種方法很容易導(dǎo)致蛋白失活。

2.2 仿生誘導(dǎo)法

仿生誘導(dǎo)法［14］是對水蛭活體進(jìn)行誘導(dǎo)使其分泌唾液，再對唾液進(jìn)行分離提純，這種方法避免了傳統(tǒng)方法對水蛭素的一次性掠奪，保護(hù)了水蛭的野生資源，又帶動了水蛭養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。誘導(dǎo)的方法通常分為兩種，一種是利用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)，能夠刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液的化學(xué)物質(zhì)包括無機(jī)鹽、有機(jī)酸和濃度較低的無機(jī)酸，酸溶液濃度為0.1%～3%，PH 在4.5～6.8之間［15］。其中田麗華［16］研究發(fā)現(xiàn)用氯化鈉配合L-精氨酸對水蛭的誘導(dǎo)效果較好。

另一種是生物誘導(dǎo)方法，即利用豬血、田螺等構(gòu)成誘導(dǎo)系統(tǒng)，對水蛭進(jìn)行數(shù)天饑餓處理后，在室溫中性環(huán)境下對水蛭活體進(jìn)行誘導(dǎo)［17］。生物誘導(dǎo)系統(tǒng)由蚯蚓提取液、殼聚糖、黃芪多糖、葡萄糖粉組成，隨后利用硫酸鋅與乙醇的混合液組成的催吐劑進(jìn)行催吐。

2.3 超聲提取法

超聲提取法是將水蛭用組織勻漿機(jī)勻漿后，放入生理鹽水稀釋后，用20～25 KHz 的超聲波粉碎，再用三氯乙酸提取蛋白［18］。在傳統(tǒng)的勻漿實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞還未完全裂解，大量的水蛭素還存留在勻漿液中的水蛭體內(nèi)，采用超聲波超微破碎處理迅速破壞細(xì)胞，使得提取水蛭素效率大大提高［18］。

2.4 酶解法

酶解法［19］是以蛋白質(zhì)作為原料，再利用合適的蛋白酶對這些蛋白進(jìn)行水解，把其中的生物活性肽段釋放出來。侯會會在酶解法的基礎(chǔ)上做了創(chuàng)新，用堿性蛋白酶酶解法提取水蛭素，將蛋白類大分子水解成具有一定活性的小分子物質(zhì)，從而獲得較高的提取效率［19］。由于此方法的高安全性以及蛋白原料的可選擇性，使其在醫(yī)療行業(yè)具有優(yōu)良的研究前景。

3 純化方法

水蛭素的純化主要利用陰離子交換層析法、凝膠過濾色譜法、反相高效液相色譜法、超濾法、雙水相萃取法以及近年來興起的酶固定化法和特異性結(jié)合的方法等，各種純化方法對水蛭的純化程度也都不一樣。水蛭素的純度直接影響其療效，但是純度的提高必然會使提純的工藝更加繁瑣，因此找到合適的提純工藝至關(guān)重要。

3.1 陰離子交換色譜法

陰離子交換色譜法是水蛭素分離提純應(yīng)用最廣的方法。DEAE-C52 纖維柱［20］和Q Sepharose 快速層析柱［21］都可以對水蛭素進(jìn)行洗脫，收集每個峰的成分，并檢測每個峰的活性。此外馮會藏［22］等基于傳統(tǒng)的陰離子柱層析法做了改進(jìn)，采用孔徑更大的DEAE-硅膠分離柱，用純鹽溶液作流動相，通過調(diào)節(jié)流動相離子濃度進(jìn)行梯度洗脫提純。這種方法分離特異性好，容易操作，但是需要后期除鹽。

3.2 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法是利用蛋白質(zhì)分子量的大小進(jìn)行分離純化，一般先用Sephadex G-75 凝膠過濾柱對水蛭素粗品洗脫分離，接著用Sephadex G-25 層析柱完成脫鹽處理［20］。這種方法可用于蛋白分離和脫鹽，但收集到的抗凝血活性物質(zhì)比較少，并且洗脫后的樣品會被大量稀釋，降低了最終活性物質(zhì)的純度，因此用這種方法純化后需要濃縮處理。

3.3 反向高效液相色譜法

反向高效液相色譜是由非極性固定相十八烷基鍵合硅膠和甲醇、乙腈等極性流動相所組成的色譜體系，與高效液相色譜體系組成相反，能更好地調(diào)整分離效果，可用于水蛭素的進(jìn)一步純化和含量測定。段超［14］等用經(jīng)Sephadex G-25 凝膠過濾后的提純液，采用含有0.1%三氟乙酸的乙腈水溶液洗脫提純，收集活性峰所在處的成分，得到更高純度的水蛭素。

3.4 超濾提純法

超濾提純就是利用聚砜膜濾過技術(shù)，對水蛭素進(jìn)行分離，通常利用聚砜PS1（截留分子量10 000）和PS2（截留分子量5 000），段超用此方法在0.20MPa 的氮?dú)鈮合鲁瑸V［14］，這種分離蛋白的方法效率較高，容易操作，但是后續(xù)的膜清洗比較困難，若清洗不干凈會影響后續(xù)物質(zhì)的分離。

3.5 雙水相萃取法

雙水相萃?。?3］是將化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的親水性聚合物形成互不相溶的上、下兩相，利用目的物在兩相的分配差異而進(jìn)行萃取的技術(shù)。方富永［24］用雙水相萃取-凝膠色譜聯(lián)用的方法純化水蛭素粗提液得到純度較高的產(chǎn)品。此方法分離條件溫和、成本低、具有良好的研究前景。

3.6 酶固定化法

酶的固定化是用固體材料將酶固定在一定區(qū)域內(nèi)，使其進(jìn)行可重復(fù)性催化反應(yīng)。苗艷麗等人采用絲素固定化凝血酶法［25］以脫膠家蠶絲素為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑分離純化菲牛蛭中的水蛭素，迅速分離出高純的水蛭素。這種方法在工業(yè)生產(chǎn)中具有優(yōu)良前景。

3.7 特異性結(jié)合法

特異性結(jié)合法基于生物親和的方法，是近年來用于快速篩選和鑒定復(fù)雜物質(zhì)中的特定目標(biāo)的新方法。原理是生物分子之間的可逆相互作用，在配體和蛋白質(zhì)之間發(fā)生親和相互作用后，THR 和配體被解離和洗脫，而未與目標(biāo)結(jié)合的化合物將被丟棄。QY Huang 等人用此原理從水蛭中發(fā)現(xiàn)一種新型凝血酶抑制肽［26］，此后QY Huang 以凝血酶為靶向物質(zhì)，用親和超濾和UPLC-HR-Orbitrap-MS 的方法從菲牛蛭體內(nèi)篩選出了具有抗凝血活性的凝血酶靶向小分子［27］。這種方法可以篩選具有可逆性的組件與靶蛋白的結(jié)合效應(yīng)，對目標(biāo)具有親和力的化合物將被獲取并進(jìn)一步分析。

4 小結(jié)與展望

水蛭素作為目前所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然抗凝血酶活性物質(zhì)，其開發(fā)及利用受到醫(yī)療行業(yè)的重視。通過比較分析三種常見的水蛭，其中菲牛蛭體內(nèi)的菲牛蛭素與水蛭素藥理作用相同，結(jié)構(gòu)相似，此外菲牛蛭素的抗凝血活性優(yōu)于水蛭素，同時菲牛蛭體型大、生存能力較強(qiáng)，可節(jié)約原料成本，極具研究前景。仿生誘導(dǎo)水蛭素的方法簡便可行，與其他傳統(tǒng)方法相比，此方法為水蛭素的持續(xù)利用提供了道路，既保護(hù)了水蛭的資源，也為水蛭素的產(chǎn)業(yè)化提供了便利。在水蛭素純化階段可以看出，分離純化步驟越多，產(chǎn)品的損耗也就越大。在工業(yè)生產(chǎn)上，人們應(yīng)向著分離純化有合理的成本和效率等方面發(fā)展，同時要保留水蛭素的結(jié)構(gòu)完整性及其生物的活性。

國內(nèi)外通過基因工程技術(shù)獲得與天然水蛭素極其相似的重組水蛭素，并且注射和口服均可發(fā)揮藥效，可它在63 位酪氨酸殘基處未磺酸化，這使得重組水蛭素對凝血酶的抑制效果較天然水蛭素大幅度降低，臨床效果也低于天然水蛭素［28］。因此，對于開發(fā)新的重組水蛭及其他水蛭肽類衍生物也還有很遠(yuǎn)的路程。