桃紅四物湯醇提液的薄層分離與定性鑒別

宋天寶 尤斯涵 董明綱 郭春燕

1.河北北方學(xué)院，張家口，075000，中國

2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津，301617，中國

桃紅四物湯亦稱加味四物湯，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地、白芍和川芎六味藥組成。來源于《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》（卷四十四），為調(diào)經(jīng)藥方之一，功效為調(diào)經(jīng)止痛、活血化瘀、養(yǎng)血補(bǔ)血［1-2］，主治血虛兼血瘀癥，是藥性比較平和安全有效的活血祛瘀名方［3］。現(xiàn)代研究表明，桃紅四物湯具有擴(kuò)張血管、抗炎、抗疲勞、抗休克、抗過敏、降脂、調(diào)節(jié)免疫功能、補(bǔ)充微量元素等作用。桃紅四物湯中含有多種有機(jī)成分，如：芳香酸、生物堿、多糖、黃酮、揮發(fā)油、單萜類糖苷、芳香族氰苷等，還含有氨基酸、維生素等人類必需的營養(yǎng)成分，以及無機(jī)成分鐵、鋅、銅、鈷等元素［4］。目前，中藥成分分析和質(zhì)量控制方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）等。TLC 與HPLC 和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用相比較，具有樣品預(yù)處理簡單，儀器設(shè)備成本、耗材成本低廉；操作簡便、直觀性強(qiáng)、適用性廣［5-6］等特點(diǎn)。TLC 可以幾十個(gè)樣品同時(shí)在一個(gè)薄層板上進(jìn)行分離分析。通過紫外燈照射、顯色、薄層掃描等方法鑒別含有特定官能團(tuán)的物質(zhì)［7］，與對(duì)照品結(jié)果比較，結(jié)合薄層掃描得到的光譜圖和比移值，可以進(jìn)行定性分析，在基層快檢和中藥分析中具有重要意義［8］。本研究采用薄層色譜法對(duì)桃紅四物湯醇提液中的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒別。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品

阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷對(duì)照品，購自中檢所，純度＞98%。

1.1.2 藥材

桃仁，批號(hào)：20130321，河北；紅花，批號(hào)：20140101，新疆；川芎，批號(hào)：20140401，四川；當(dāng)歸，批號(hào)：20130801，甘肅；生地，批號(hào)：20141203，山西；白芍，批號(hào)：20130401，安徽。

1.1.3 試劑

試劑乙醇（分析純）、甲醇（分析純），均購自天津市北方化玻購銷中心；試劑正丁醇（分析純），購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；試劑冰乙酸（分析純），購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

硅膠G 薄層板，青島海洋化工有限公司；薄層色譜展開缸，上海信誼儀器廠有限公司；SB-800DT 超聲波清洗器，浙江省寧波市新芝生物科技股份公司；K-H3000 型薄層掃描儀，上海科哲生化科技有限公司；ZF-6 型三用紫外線分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；LC-4012 低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；ME235P 電子分析天平，德國。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 桃紅四物湯醇提液及各單味藥醇提液的制備參照國家中醫(yī)藥管理局會(huì)同國家藥品監(jiān)督管理局制定《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》目錄中記載的桃紅四物湯各單味藥比例混合，以料液比1∶8 加入50%的乙醇超聲提取30 min，離心，取上清液。采用同法，制備各單味藥。稀釋定容至適當(dāng)濃度，備用。

1.2.1.2 對(duì)照樣品的制備 電子天平精密稱取羥基紅花黃色素A 適量加50% 的甲醇溶解成2 mg·mL-1、芍藥苷適量加50% 的甲醇溶解成2 mg·mL-1、阿魏酸適量加50% 的甲醇溶解成1 mg·mL-1，作為對(duì)照品備用。

1.2.2 醇提液的薄層分離和鑒別

硅膠G 薄層板（100 mm×200 mm）上分別點(diǎn)樣桃紅四物湯提取液、各單味藥的提取液和上述對(duì)照品溶液，以正丁醇-冰乙酸-水（4∶1.5∶5，上層）為展開劑，展開、取出、晾干，置于紫外燈（365 nm）下檢視，并進(jìn)行下一步操作。

1.2.3 醇提液的薄層掃描和定性鑒別

在紫外燈（365 nm）下觀察薄層板上的斑點(diǎn)，記錄斑點(diǎn)位置。再將薄層板用碘蒸氣顯色，記錄斑點(diǎn)位置，并對(duì)所有斑點(diǎn)進(jìn)行薄層掃描，確定各個(gè)斑點(diǎn)的光譜特征和比移值。比較桃紅四物湯醇提液、各單味藥醇提液斑點(diǎn)和對(duì)照品的最大吸收波長、光譜特征和比移值，進(jìn)行定性鑒別。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯醇提液和各單味藥薄層分離結(jié)果

桃紅四物湯醇提液定性鑒別出5 個(gè)成分，其最大吸收波長和比移值見表1；依據(jù)吸收波長和比移值確定，有3 個(gè)成分分別為羥基紅花黃色素A（來自紅花）、芍藥苷（來自白芍）、阿魏酸（來自當(dāng)歸和川芎）。另外，在桃紅四物湯中有兩個(gè)成分在組成桃紅四物湯的各個(gè)單味藥中均未檢出。

表1 桃紅四物湯醇提液和各單味藥薄層分離結(jié)果

2.2 桃紅四物湯已知化學(xué)成分對(duì)照品的薄層分析結(jié)果

2.2.1 羥基紅花黃色素A 掃描結(jié)果

羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）對(duì)照品的掃描結(jié)果如圖1-B，有2 個(gè)峰值吸收分別為351 nm、425 nm，1 個(gè)谷值吸收為383 nm；THSW-1（圖1-A）、HH-1（圖1-C）與HSYA（圖1-B）的光譜特征完全一致，比移值均為0.34，見表2。

圖1 HSYA 薄層掃描結(jié)果

2.2.2 芍藥苷掃描結(jié)果

芍藥苷對(duì)照品的掃描結(jié)果，如圖2-B，有3 個(gè)峰值吸收分別為234 nm、293 nm、352 nm，2 個(gè)谷值吸收分別為260 nm、325 nm；THSW-4（圖2-A）、BS-2（圖2-C）與PF（圖2-B）的光譜特征完全一致，比移值均為0.77，見表2。

表2 桃紅四物湯薄層分離斑點(diǎn)的定性鑒別

圖2 芍藥苷（PF）薄層掃描結(jié)果

2.2.3 阿魏酸掃描結(jié)果

阿魏酸對(duì)照品的薄層掃描結(jié)果見圖3-B，有2 個(gè)峰值吸收分別為228 nm、301 nm，1 個(gè)谷值吸收為251 nm，THSW-5（圖3-A）、FA（圖3-B）、CX-1（圖3-C）和 DG-1（圖3-D）的光譜特征完全一致，比移值均為0.97，見表2。

圖3 FA 薄層掃描結(jié)果（A：THSW-5；B：FA；C：CX-1；D：DG-1）

2.3 薄層掃描結(jié)果分析

根據(jù)掃描結(jié)果，雖然桃紅四物湯醇提液第二個(gè)斑點(diǎn)與紅花醇提液第二個(gè)斑點(diǎn)的比移值相同為0.45，但是吸收光譜特征不同（圖4），桃紅四物湯有1 個(gè)峰值吸收為309 nm，1 個(gè)谷值吸收為240 nm；紅花有2 個(gè)峰值吸收分別為218 nm、311 nm，1 個(gè)谷值吸收為238 nm，提示桃紅四物湯醇提液第二個(gè)斑點(diǎn)可能為新產(chǎn)生的化學(xué)成分。

圖4 THSW 和 HH 的薄層掃描（A：THSW；B：HH）

根據(jù)掃描結(jié)果，雖然桃紅四物湯醇提液第三個(gè)斑點(diǎn)與川芎醇提液第一個(gè)斑點(diǎn)的比移值相同為0.51，但是吸收光譜特征不同（圖5），桃紅四物湯有1 個(gè)峰值吸收為273 nm，1 個(gè)谷值吸收為243 nm；川芎有3 個(gè)峰值吸收分別為227 nm、303 nm、439 nm，2 個(gè)谷值吸收分別為260 nm、395 nm，且在紫外燈（365 nm）照射下斑點(diǎn)顏色也不相同，在其它單味藥中均未檢出，提示桃紅四物湯醇提液第三個(gè)斑點(diǎn)可能為新產(chǎn)生的化學(xué)成分。

圖5 THSW 和 CX 的薄層掃描（A：THSW；B：CX）

3 討論

本研究中桃紅四物湯提取液的溶劑采用50%的乙醇，提取獲得的化學(xué)成分為極性較大成分。薄層色譜展開中針對(duì)極性較大組分的常用展開劑有：正丁醇-冰乙醇-水（4∶1∶5，上層）、乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶5∶1）、三氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，下層）、三氯甲烷-甲醇（8∶1）［9］。本研究根據(jù)實(shí)際情況，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中選擇毒性較小和實(shí)驗(yàn)室較常用正丁醇-冰乙酸-水（4∶1∶5，上層）作為展開劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但分離效果和比移值均不太理想。后調(diào)整展開劑中正丁醇-冰乙酸-水的比例，調(diào)整為正丁醇-冰乙酸-水（4∶1.5∶5，上層），展開結(jié)果效果較好。除去THSW-5 成分外，其它成分比移值在0.2～0.8 之間。

薄層色譜方法用于定性鑒別的特點(diǎn)：如果紫外光譜圖輪廓一致并且比移值相同，可以初步斷定為同一物質(zhì)。如果紫外光譜圖輪廓存在明顯差異，可以斷定肯定不是同一物質(zhì)。本研究采用薄層色譜方法快速分離和初步鑒定了桃紅四物湯中的幾個(gè)化學(xué)成分。也肯定了合煎之后產(chǎn)生了新的物質(zhì)，這是首次發(fā)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了中醫(yī)理論中的復(fù)方提取物合煎和單煎化學(xué)成分存在差異，也驗(yàn)證了合煎之后有新物質(zhì)的產(chǎn)生。

盡管薄層色譜分離方法簡單快速。但無法推斷所產(chǎn)生的新的化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。今后需采用制備薄層色譜后，結(jié)合紫外、紅外、質(zhì)譜和核磁進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。