口腔癌頜骨侵犯的分子機制研究進展

劉偉 李春潔 李龍江

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科，成都610041

口腔癌是頭頸部最為常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例超過30 萬例[1]，其中超過90%為口腔鱗狀細胞癌。口腔癌的發(fā)生是多因素作用的結(jié)果，其中吸煙、酗酒、咀嚼檳榔等不良生活習慣是重要的危險因素。當口腔癌發(fā)生于牙齦、口底、舌等與頜骨毗鄰的解剖位置時，易于發(fā)生頜骨侵犯。頜骨侵犯者通常需要通過外科手術(shù)一并切除相應(yīng)的部分受侵頜骨，以求達到腫瘤外科的“安全邊界”，但由此產(chǎn)生的咀嚼、吞咽、語言功能及面部外形破壞將極大地影響患者的生存質(zhì)量。因此頜骨侵犯也預(yù)示著患者更差的預(yù)后[2-3]。雖然近年來治療水平不斷提高，但是口腔鱗狀細胞癌的5年生存率依舊較低。為了更加準確的診斷和更有效的治療，就必須要更加深入地了解口腔癌頜骨侵犯的分子機制，本文對口腔癌頜骨侵犯的分子機制的研究進展作一綜述。

1 破骨細胞在口腔癌頜骨侵犯中的核心地位

Carter[4]在1985 年就提出，口腔癌對下頜骨的侵犯不是由口腔癌細胞自身進行，而是由破骨細胞所參與的。因此，要了解口腔癌下頜骨的侵犯機制，首先應(yīng)該了解破骨細胞形成及其功能調(diào)控的機制。

破骨細胞是一種多核細胞，來源于單核巨噬細胞系統(tǒng)，由多個單核細胞融合而成，在生理性的骨重塑和病理性的骨吸收過程中扮演著不可替代的角色。因此，在人體中，破骨細胞的形成及功能的活化受到了嚴密的調(diào)節(jié)。從破骨細胞形成到骨溶解的過程包括了幾個重要的步驟：骨髓造血干細胞增殖分化形成單個核的破骨細胞前體，單個核的破骨細胞前體融合為多核破骨細胞，多核破骨細胞功能活化，緊貼于骨面，褶皺緣及亮區(qū)形成，進行破骨。破骨細胞形成和活化被一套復(fù)雜的信號系統(tǒng)所控制，其中包括了4種重要的信號分子：核因子κB受體活化因子配體（receptor ac‐tivator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）、核因子κB 受體活化因子（receptor activator for nucle‐ar factor-κB，RANK）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和巨噬細胞集落刺激因子（macrophage col‐ony stimulating factor，M-CSF）。M-CSF 能刺激造血干細胞增殖分化為破骨細胞前體，RANK 是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族的一種Ⅰ型跨膜蛋白，在M-CSF存在的情況下，表達在破骨細胞前體及成熟破骨細胞上的RANK與其配體RANKL結(jié)合后能促進破骨細胞的形成與功能活化，實現(xiàn)對骨質(zhì)的吸收。而OPG 作為RANKL 的“誘騙受體”可與RANKL 結(jié)合，從而抑制RANKL 與RANK 結(jié)合所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，RANKL及OPG表達的平衡對于破骨細胞分化及功能的行使極為重要，RANKL/OPG比例失調(diào)在多種與骨代謝失常有關(guān)的疾病中可以查見[5-7]?？谇话┓置诙喾N細胞因子并直接或間接參與RANKL/RANK 信號通路的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控破骨細胞生成和功能來實現(xiàn)對頜骨的侵犯。

2 口腔癌對破骨細胞形成及其功能的影響

2.1 口腔癌參與調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG 的表達從而影響破骨細胞形成和活化

RANKL/RANK 信號通路在調(diào)控腫瘤的骨侵犯及骨轉(zhuǎn)移中具有重要作用，這種現(xiàn)象在乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、惡性黑色素瘤[10]中均有研究。作為破骨細胞形成和激活過程中最為關(guān)鍵的一環(huán)，口腔癌也可以通過直接參與該信號通路來實現(xiàn)骨侵犯。研究顯示，表達RANKL的癌細胞有時并不需要其他細胞的參與便能夠?qū)е缕乒羌毎桑欢煌谇话┘毎鸕ANKL的表達呈現(xiàn)不同水平。Zhang等[11]檢測了OSCC3、UMSCC-74B、UMSCC-11B等細胞系RANKL 的表達情況，發(fā)現(xiàn)RANKL 既有膜結(jié)合型又有分泌型，且表達的量呈現(xiàn)不同水平；將上述口腔癌細胞或者相應(yīng)的條件培養(yǎng)基和鼠源性巨噬細胞RAW264.7直接共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)破骨細胞形成，用OPG 或者抗RANKL 抗體可以消除這一效應(yīng)，在人外周血單核細胞中也可觀察到類似現(xiàn)象，研究者進一步建立含人RANKL啟動子熒光素酶報告基因的UMSCC-11B 的細胞系，用其構(gòu)建小鼠骨侵犯模型，證明了在骨侵犯過程中RANKL表達被激活，這說明口腔癌細胞產(chǎn)生的RANKL可以直接導(dǎo)致溶骨性骨吸收。

口腔癌細胞除了可以直接產(chǎn)生RANKL 外，還能通過影響基質(zhì)細胞、成骨細胞等的RANKL、OPG 的表達間接地促進骨侵犯。研究[12]表明，BHY 細胞作為一種對下頜骨及口底肌群有高度侵襲性的口腔癌細胞，雖然其表面表達RANKL，但其與小鼠骨髓細胞共培養(yǎng)時，僅極少量破骨細胞形成，再加入小鼠成骨細胞則顯著促進破骨細胞形成，而HSC-2 細胞系不能夠表達RANKL，但是卻能夠促進小鼠成骨細胞和骨髓細胞共培養(yǎng)體系中破骨細胞形成。進一步研究[13]表明，BHY 細胞和HSC-2 細胞能夠明顯抑制小鼠成骨細胞合成OPG，這提示口腔癌細胞可以通過下調(diào)成骨細胞OPG 的表達來促進破骨細胞的形成。研究[14-15]顯示，口腔癌頜骨侵犯過程中，口腔癌細胞和骨表面之間有纖維結(jié)締組織的存在，該處成纖維細胞高表達RANKL，并且其數(shù)量與界面中破骨細胞數(shù)量呈正相關(guān)。Sato等[16]在小鼠骨髓細胞、小鼠來源的成骨細胞系UAMS-32 細胞、人口腔癌細胞系HSC3 或HO-1-N-1 的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)體系中分別用抗人或抗小鼠的抗RANKL抗體，均可使破骨細胞生成減少，證明口腔癌細胞和基質(zhì)細胞產(chǎn)生的RANKL 均可參與破骨細胞生成的調(diào)節(jié)。Quan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌細胞的條件培養(yǎng)基不僅能使成骨細胞RANKL/OPG 的比例上升，也能增加MMP9在成骨細胞中的表達。Elmusrati等[18]首次證實了癌癥相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibro‐blasts，CAF）在口腔癌頜骨侵犯中的作用，發(fā)現(xiàn)α-SMA 陽性的CAF 可以先于腫瘤細胞出現(xiàn)在骨質(zhì)中，其自身高表達RANKL，同時可以使成骨細胞RANKL表達增加，OPG表達減少。

2.2 其他細胞因子在口腔癌頜骨侵犯中的作用

Shibahara等[19]通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，有下頜骨侵犯的下頜牙齦癌標本中高表達甲狀旁腺激素相關(guān)肽（parathyroid hormone-related peptide，PTHrP）、TNF-α、白細胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）和IL-11。Nomura等[20]通過小鼠來源的口腔鱗狀細胞癌細胞系SCCVⅡ建立口腔癌頜骨侵犯動物模型，檢測到模型標本中IL-6、PTHrP 和TNF-α表達增加，這為進一步探究這些細胞因子與口腔癌頜骨侵犯之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。Deyama等[21]研究表明，BHY 細胞表達轉(zhuǎn)化生長因子β（trans‐forming growth factor-β，TGF-β）、IL-1β、IL-8、PTHrP、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA，用BHY細胞的條件培養(yǎng)基可以促進成骨細胞IL-6、RANKL 的mRNA 表達。進一步研究[22]發(fā)現(xiàn)，BHY 細胞或BHY 細胞的條件培養(yǎng)基能夠通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extra‐cellular signal-regulated kinase，ERK），抑制促凋亡蛋白Bim，使破骨細胞存活時間延長。Takayama等[23]發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定敲低THrP 的SCCVⅡ細胞系誘導(dǎo)破骨細胞形成的能力降低，相應(yīng)小鼠模型中骨侵犯程度降低。Kayamori等[24]揭示了口腔癌細胞過表達PTHrP并能誘導(dǎo)基質(zhì)細胞產(chǎn)生IL-6從而刺激基質(zhì)細胞產(chǎn)生RANKL。另外，Shimo等[25]發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織生長因子CCN2 在對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用，又進一步研究[26]證明了CCN2與口腔癌頜骨侵犯的相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)重組人CCN2能促進小鼠骨髓細胞形成抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resis‐tant acid phosphatase，RTAP）陽性破骨細胞。

鑒于此，一些學(xué)者試圖通過檢測術(shù)前活檢標本中一些細胞因子和破骨細胞相關(guān)酶類的表達情況來推測頜骨侵犯的情況。Cui等[27]通過對30 例口腔癌術(shù)前活檢標本進行TRAP和細胞因子的免疫組織化學(xué)雙重染色，將染色結(jié)果與手術(shù)后病理結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)：雙陽性和RANKL、PTHrP、IL-1α陽性對于口腔癌頜骨侵犯有診斷意義，雙陰性對于未發(fā)生頜骨侵犯有預(yù)測意義。然而van Cann 等[28]通過對35 例標本的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6、IL-11的表達情況和口腔癌是否發(fā)生骨髓侵犯并沒有直接聯(lián)系。

近年來，趨化因子在口腔癌頜骨侵犯中的作用也受到學(xué)者們的關(guān)注。趨化因子是一類小分子類肝素結(jié)合肽，是細胞因子中的一個超家族，對白細胞有趨化作用。Yuvaraj等[29]研究表明，趨化因子配體-13（chemokine cc-motif ligand 13，CX‐CL13）/趨化因子受體-5（chemokine receptor，CX‐CR5）/活化T 細胞核因子c3（nuclear factor of acti‐vated T-cells cytoplasmic 3，NFATc3）信號軸在誘導(dǎo)口腔癌細胞表達RANKL 中具有作用。該團隊[30]進一步研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌細胞表達CXCL13 并可與基質(zhì)細胞/前成骨細胞上的CXCR5結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 從而誘導(dǎo)后者表達RANKL。Oue等[31]研究發(fā)現(xiàn)，2種來源于人舌癌的細胞系HSC3-C13、HSC3-C17 在誘導(dǎo)破骨細胞生成能力方面具有區(qū)別，然后通過基因芯片技術(shù)比較了2種細胞基因表達的差異，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)破骨細胞生成能力更強的HSC3-C13細胞更多的表達CXCL2基因，抑制CX‐CL2 的表達可以減少共培養(yǎng)體系中破骨細胞生成，而使用重組人CXCL2 則可增加基質(zhì)細胞RANKL表達。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotac‐tic protein-1，MCP-1）是趨化因子超家族的一員。學(xué)者[32-33]發(fā)現(xiàn)，MCP-1 在口腔癌手術(shù)標本及口腔癌細胞系SCC25、HN5、Tca8113 中高表達，用含MCP-1 的顯性負性突變體7ND 結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)染SCC-25，其條件培養(yǎng)基可以抑制CD14陽性單核細胞形成破骨細胞，用人工合成的7ND 可以讓CD14陽性單核細胞的遷移受到影響，破骨細胞生成受到抑制，7ND 對口腔癌骨侵犯的抑制作用在小鼠模型中也得到驗證。

2.3 鈣黏附蛋白（E-cadherin，E-cad）在口腔癌誘導(dǎo)的破骨細胞形成中的作用

E-cad 是可介導(dǎo)細胞之間黏附作用的鈣依賴型跨膜蛋白。學(xué)者[34]觀察到，在誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW 264.7向破骨細胞轉(zhuǎn)化過程中，其細胞表面的E-cad 的表達量會出現(xiàn)明顯的變化，即當單核細胞融合為多核破骨細胞的過程中其表面的E-cad 會逐漸減少。人為過表達E-cad 的鼠巨噬細胞中與破骨細胞形成密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NFATC1能更早地出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，更快地融合成多核破骨細胞。在此基礎(chǔ)上，有學(xué)者[35]通過間接共培養(yǎng)SCC25 和RAW 264.7，并用TGF-β1 人工誘導(dǎo)SCC25 發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中的兩種細胞表面的E-cad 的量存在某種程度上的轉(zhuǎn)換，即SCC25 的E-cad 減少而RAW 264.7 表面的E-cad 增多，從而提出口腔癌細胞在EMT 過程中丟失的E-cad 可以被單核細胞利用，促進破骨細胞形成。然而該研究并不能排除該條件下TGF-β1 本身對單核細胞表達E-cad 是否有影響，故E-cad這種轉(zhuǎn)換有待進一步研究證實。

2.4 口腔癌頜骨侵犯相關(guān)信號通路的研究

鑒于RANKL-RANK-TRAF 途徑激活的核因子κB（nuclear factor kappa，NF-κB）信號通路在口腔癌誘導(dǎo)的破骨細胞生成中的重要作用[5,36]，學(xué)者們研究了NF-κB 通路抑制劑對于口腔癌骨侵犯的影響。當使用NF-κB 通路選擇性抑制劑NBD 肽或IKK-β 抑制劑IMD-0560 處理口腔癌頜骨侵犯模型小鼠，發(fā)現(xiàn)其可以通過抑制成骨細胞和SCCVⅡ細胞RANKL的表達減少破骨細胞生成，同時還可以抑制SCCVⅡ增殖，增加SCCVⅡ凋亡。其中IMD-0560 還能抑制腫瘤細胞MMP-9 的產(chǎn)生，說明其侵襲能力也受到抑制[37-38]。近年來，其他一些信號通路在口腔癌調(diào)控破骨細胞生成和功能活化中的作用也被廣泛關(guān)注。TGF-β信號通路在介導(dǎo)腫瘤EMT過程中已有較多研究，其在誘導(dǎo)破骨細胞形成方面的作用也被證實，Nakamura等[39]檢測到TGF-β1可以使RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞形成增加，說明了口腔癌細胞和基質(zhì)細胞產(chǎn)生的TGF-β 參與口腔癌頜骨侵犯。此外，Hedgehog信號通路也參與其中，Honami等[40]發(fā)現(xiàn)音猬蛋白（sonic hedgehog，SHH）可以刺激破骨細胞形成，用siRNA 抑制口腔癌SHH 的分泌可以減少動物模型中口腔癌的生長和破骨細胞形成。Shimo等[41]進一步揭示了口腔癌細胞產(chǎn)生的SHH 與破骨細胞及其前體細胞上SHH 受體Patched 結(jié)合通過下游信號分子Gli-2 發(fā)揮作用。有趣的是，同期的另外一份研究表明Hedgehog 信號通路與TGF-β 信號通路在信號分子Gli-2 處交匯共同調(diào)控口腔癌細胞PTHrP的表達[42]。其他如胰島素樣生長因子ⅡmRNA 結(jié)合蛋白-3（insulin-like growth factor-ⅡmRNA binding protein-3，IMP3）和平足蛋白（podoplanin，PDPN）[43]、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[44]、RUNT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（Runt-related transcription factor 3，RUNX3）[45]等分子在促進口腔癌的侵襲能力、破骨細胞形成方面的作用也有報道。這些關(guān)鍵分子在口腔癌頜骨侵犯中的作用被相繼發(fā)現(xiàn)，既說明了口腔癌頜骨侵犯分子機制的復(fù)雜性，又為尋求潛在治療靶點提供了新的方向。

3 頜骨侵犯過程對口腔癌發(fā)展的作用

當口腔癌侵犯頜骨后，其能夠在頜骨的微環(huán)境中增殖和侵犯，同時與微環(huán)境中的成骨細胞、成纖維細胞等相互作用、相互促進[24]。骨溶解過程中儲存在骨基質(zhì)中的大量生長因子被釋放，比如TGF、胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、成纖維細胞生長因子（fibro‐blast growth factor，F(xiàn)GF）等[46]，這些生長因子進入腫瘤微環(huán)境，由于口腔癌細胞具有這些生長因子的受體，因而，能夠促進增殖并抑制其凋亡[47-48]?？谇话┘毎陨硪脖磉_RANK，腫瘤微環(huán)境中各種來源的RANKL可以與其RANK結(jié)合促進口腔癌細胞的增殖。此外，在TGF-β 的誘導(dǎo)下，口腔癌細胞不僅展現(xiàn)出更高的侵襲性，其表達骨溶解相關(guān)因子如RANKL、TNF-α、CCN2、PTHrP的水平也更高，導(dǎo)致骨溶解進一步加劇，形成一種“惡性循環(huán)”。

口腔癌細胞通過產(chǎn)生MCP-1、RANKL 等使破骨細胞形成增加或通過各種細胞因子作用于腫瘤基質(zhì)細胞、成骨細胞使RANKL/OPG 比例增加，從而間接導(dǎo)致破骨細胞形成、骨溶解增加。儲存在骨基質(zhì)中的各種生長因子如TGF-β、IGF-1、FGF 等被釋放后可作用于口腔癌細胞使其增殖、侵襲遷移能力增強，形成“惡性循環(huán)”。

4 總結(jié)及展望

口腔癌頜骨侵犯的發(fā)生、診斷和治療是口腔頜面外科醫(yī)師十分關(guān)注的一個臨床問題，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。近年來學(xué)者們對于口腔癌頜骨侵犯的分子機制的研究做了大量的工作，雖尚未完全闡明，但目前可以明確：口腔癌在腫瘤-骨界面通過與基質(zhì)細胞、成骨細胞、破骨細胞的一系列互動，提供了利于破骨細胞生成和活化的微環(huán)境從而導(dǎo)致了骨的破壞，腫瘤-骨界面的細胞產(chǎn)生的和骨質(zhì)破壞過程中釋放的各種生長因子又促進了口腔癌的生長、增加了其侵襲能力，這“一退一進”導(dǎo)致口腔癌頜骨侵犯的發(fā)生發(fā)展，形成“惡性循環(huán)”。因此，在進一步完善口腔癌頜骨侵犯分子機制的基礎(chǔ)之上，尋求更加有效的方法打破其中一個或多個環(huán)節(jié)是該領(lǐng)域未來研究的方向。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。