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    3歲以下哮喘患兒糞便腸道菌群觀察

    2021-01-07 04:46:24徐偉盛偉松董娜薛娟朱丹榮錢娟
    山東醫(yī)藥 2020年36期
    關(guān)鍵詞:雙歧外周血菌群

    徐偉,盛偉松,董娜,薛娟,朱丹榮,錢娟

    南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江蘇南京 210011

    腸道是人體質(zhì)量要的免疫器官,腸道菌群對免疫系統(tǒng)具有重要影響,種類繁多的菌群對機體來說也是豐富的非自身性抗原,一方面機體對腸道菌群有互利共生作用,另一方面機體存在免疫防御機制,防止腸道菌群感染機體。同時腸道菌群可刺激增加樹突狀細胞的耐受性,通過相互作用,介導(dǎo)并促進T細胞向Th1分化[1-2]。有研究顯示,梭狀芽孢桿菌和脆弱擬桿菌能夠刺激調(diào)節(jié)性T細胞分泌IL-10,還可抑制IL-17的分泌,同時還可直接降低免疫球蛋白IgE的分泌[3]。目前,幼兒哮喘發(fā)病機制尚未完全明確,多數(shù)學(xué)者認為與細胞因子、免疫功能密切相關(guān)。有臨床研究提示,兒童腸道菌群的變化與哮喘有關(guān),不同種類腸道菌群可能通過影響免疫功能促進或抑制哮喘發(fā)生[4-6]。國內(nèi)少有學(xué)者對患兒腸道菌群情況與哮喘進行相關(guān)性研究。本研究觀察了3歲以下哮喘患兒糞便腸道菌群變化,并分析其對外周血輔助T細胞及血清炎癥因子的影響,旨在為哮喘患兒的臨床診治提供參考依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 選擇2018年1—12月南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的3歲以下哮喘患兒50例[觀察組,其中發(fā)作期患兒(出現(xiàn)氣促、胸悶等臨床表現(xiàn),肺功能檢查提示第一秒呼氣量及呼氣峰流速明顯降低,少數(shù)患兒伴有嚴重低氧血癥)21例,緩解期患兒(無氣促、胸悶等臨床表現(xiàn),肺功能檢查提示第一秒呼氣量及呼氣峰流速≥80%正常值,持續(xù)時間>4周)29例],男29例,女21例;年齡(23.73±3.48)個月;喂養(yǎng)方式為純母乳23例,純奶粉13例,混合喂養(yǎng)14例;體質(zhì)量(13.18±3.20)kg;生產(chǎn)方式為剖宮產(chǎn)23例,順產(chǎn)27例。另選同期健康體檢兒童50例(對照組),男30例,女20例;年齡(23.19±4.82)個月;喂養(yǎng)方式為純母乳24例,純奶粉11例,混合喂養(yǎng)15例;體質(zhì)量(13.28±2.86)kg;生產(chǎn)方式為剖宮產(chǎn)21例,順產(chǎn)29例。納入標準:①觀察組患兒診斷符合兒童哮喘的診斷標準[7];②年齡<3歲;③生長發(fā)育健康;④對照組為兒童保健評估為健康的3歲以下患兒。排除標準:①近1個月內(nèi)服用抗生素或腸道菌群制劑者;②應(yīng)用激素類、免疫抑制劑等藥物者;③合并有其他系統(tǒng)過敏性疾病者;④近1個月內(nèi)非哮喘疾病引起胸悶、咳嗽等疾病者;⑤無法配合研究的患兒;⑥對照組幼兒在研究期間診斷過敏性疾病者;⑦合并嚴重肝腎疾病者。本研究已經(jīng)通過我院倫理委員會批準,所有入組幼兒均由監(jiān)護人簽署知情同意書。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異,具有可比性。

    1.2 糞便腸道菌群檢測 收集糞便標本于無菌干燥瓶內(nèi),取1 g大便標本,加入9 mL磷酸緩沖鹽溶液,搖蕩至少5 min充分混勻,在離心機中以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,提取上清液,重復(fù)操作3次,在離心機中以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min,待沉淀后以磷酸緩沖鹽溶液清洗4次,加入0.1 mL蒸餾水至懸浮,加入1%TritonX-100使細菌壁破碎,釋放出DNA,持續(xù)煮沸5 min,放入冰水中冷卻。選取熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑盒進行檢測,引物由重慶澤恒生物技術(shù)有限公司合成,大腸桿菌:上游序列5′-GATACTGGCTAAGTACGAGCTC-3′,下游序列5′-CAGTTTGCAGGAGTCGCACT-3′,共擴增200 bp。雙歧桿菌:上游序列5′-CGTGATGCCTGACTGGAGTA-3′,下游序列5′-CTGATGCCGACTTAGCGTCGCA-3′,共擴增95 bp。PCR反應(yīng)條件:100 ℃、45 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個循環(huán);72 ℃、10 min。采用2-ΔΔCt的計算方法算出目的基因相對表達量,并計算雙歧桿菌與大腸桿菌的比值(B/E)。

    1.3 外周血輔助T細胞檢測 ①Th1、Th2:選擇100 μL的全血標本,以1∶1比例用RPMI1640進行稀釋,添加10 μL刺激劑,在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)后混勻,添加CD3-PC5及CD8-PC7各10 μL,在室溫條件下,避光孵育15 min;添加固定液100 μL;在室溫條件下,避光孵育15 min;添加3 mL的磷酸緩沖鹽溶液,以1 200 r/min離心5 min,棄上清液。管中添加100 μL破膜和溶血液,同時管中加入10 μL的IL-4-PE以及IFN-γ-FITC,在室溫條件下,避光孵育15 min。各個管中添加3 mL磷酸緩沖鹽溶液,在以1 200 r/min的速度離心5 min,棄上清液,0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸細胞,在機上進行檢測,每次對每個樣本檢測10 000個細胞。②Treg:取100 μL的全血標本,添加CD4-FITC及CD25-PE刺激劑10 μL,在4 ℃下避光孵育30 min,添加1 mL氯化銨紅細胞裂解液裂解10 min,以磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次,洗滌時轉(zhuǎn)速為1 200 r/min,時間為5 min;以1 mL Perm/Fixation緩沖液穿膜45 min,洗滌后加入鼠抗人Foxp3單克隆抗體,在4 ℃條件下避光孵育30 min。洗滌2次后以300 μL流式細胞染色緩沖液重懸,同時上FACSCanto進行檢測。應(yīng)用BDFACSDiva軟件對數(shù)據(jù)進行分析,算出細胞數(shù)中Foxp3+細胞的百分比。每次對每個樣本檢測10 000個細胞,隨后計算Th1、Th2、Treg的百分比及Th1/Th2比值。

    1.4 血清炎癥檢測 取ELISA試劑盒,放至室溫,在孔內(nèi)加入樣本、標準品,對照孔不加,在37 ℃條件下孵育30 min,洗滌3次。每孔內(nèi)添加100 μL的酶標記抗體,在37 ℃條件下孵育40 min,洗滌3次。每孔內(nèi)添加50 μL的酶底物,置于室溫條件下暗盒內(nèi)進行顯色10 min。每孔內(nèi)添加50 μL的終止液以終止反應(yīng)。選擇酶標儀在450 nm下讀取OD值,繪制標準曲線后,計算IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-γ水平。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組糞便雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量及B/E比較 糞便雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量及B/E比較見表1。

    表1 兩組糞便雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量及B/E比較

    2.2 兩組外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比較 外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比較見表2。

    表2 兩組外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比較

    2.3 兩組血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較 血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平見表3。

    表3 兩組血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較

    2.4 觀察組患兒腸道菌群變化與免疫功能的相關(guān)性 觀察組B/E與Th1/Th2、Treg呈正相關(guān)(r=0.743、0.787,P均<0.05),發(fā)作期B/E與Th1/Th2、Treg呈正相關(guān)(r=0.889、0.779,P均<0.05),緩解期B/E與Th1/Th2、Treg無相關(guān)性(r=-0.248、0.156,P>0.05)。

    3 討論

    近年來,幼兒哮喘的發(fā)病率明顯升高,影響幼兒的生長發(fā)育。哮喘的病理特征是氣道黏膜內(nèi)大量炎性細胞的浸潤,進而合成并釋放大量的炎癥介質(zhì),導(dǎo)致患兒氣道黏膜內(nèi)炎癥發(fā)生引起哮喘[8]。目前,在臨床上多數(shù)3歲以下幼兒哮喘癥狀表現(xiàn)不明顯,往往缺乏典型癥狀表現(xiàn),造成了一部分3歲以下幼兒在發(fā)病早期或者癥狀不典型時診斷較為困難,同時還有一些并發(fā)癥可能會影響哮喘的診治。哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,尤其是對于處在生長發(fā)育期的幼兒來說,可能會對3歲以下幼兒的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。3歲以下幼兒臨床癥狀無法真實準確反應(yīng)呼吸道的炎癥水平,而尋找有效的檢驗指標反映臨床癥狀有重要意義。

    腸道菌群能夠增強幼兒免疫應(yīng)答水平,能夠促進T細胞分化,同時還可以刺激免疫細胞產(chǎn)生炎癥因子,機體主要通過幾種方式對腸道內(nèi)的細菌產(chǎn)生作用;一是腸杯狀細胞的上皮表面存在粘液層,能夠組織細菌滲透;二是上皮細胞內(nèi)分泌的凝集素能夠有效限制細菌滲透;三是少數(shù)細菌能夠到達腸固有層,在到達固有層后,會被樹突狀細胞呈遞至B細胞,B細胞再分化為漿細胞進而分泌特異性IgA發(fā)揮作用。同時有研究顯示,腸道細菌能夠影響巨噬細胞等的代謝途徑,進而增強巨噬細胞的功能,促進腫瘤壞死因子-α以及IL-10的分泌[9-10]。本文結(jié)果顯示,觀察組雙歧桿菌及B/E低于對照組,觀察組發(fā)作期患兒雙歧桿菌以及B/E低于緩解期患兒,推測哮喘發(fā)生與雙歧桿菌的數(shù)量減少有關(guān)。腸道菌群在患病幼兒與健康幼兒也存在差異,在土耳其的一項以0~3歲兒童作為對象的研究中,發(fā)現(xiàn)哮喘患兒的雙歧桿菌數(shù)量明顯低于正常兒童[11]。而ZHU等[12]對小鼠腸道菌群的功能進行基因表達譜分析,結(jié)果提示小鼠腸道菌群的分布與炎癥反應(yīng)相關(guān)。

    在對T細胞亞群的分析中,觀察組外周血Th1、Th1/Th2以及Treg明顯低于對照組,Th2高于對照組;觀察組發(fā)作期患兒外周血Th1、Th1/Th2以及Treg低于緩解期患兒,發(fā)作期患兒外周血Th2高于緩解期患兒。提示在哮喘兒童中存在T細胞免疫水平的異常,主要為降低Th1、Treg的水平,提高Th2水平,破壞了Th1/Th2的平衡。QIAN等[13]對早期小鼠哮喘模型進行研究顯示,發(fā)現(xiàn)早期小鼠哮喘模型存在Th1/Th2的失衡,支持本研究結(jié)果。本相關(guān)性分析顯示,觀察組及觀察組發(fā)作期患兒外周血B/E與Th1/Th2、Treg均具有相關(guān)性。說明在三歲以下哮喘患兒中,腸道菌群情況能夠影響哮喘病情和免疫功能,其機制可能為哮喘患兒中,雙歧桿菌數(shù)量降低,促進Th2細胞分泌IL-4、IL-5,抑制Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ。劉鋼等[14]對兒童哮喘與幽門螺桿菌感染情況進行了研究,提示幽門螺桿菌感染后會致使免疫系統(tǒng)功能紊亂,促使哮喘癥狀加重,結(jié)合本研究,胃腸道是相連接的,哮喘患兒腸道內(nèi)的菌群有差異,也會導(dǎo)致患兒哮喘的發(fā)生,支持本次結(jié)果。

    本研究還對相關(guān)的炎癥因子進行了研究,結(jié)果顯示觀察組血清IL-1、IL-4、IL-5水平明顯高于對照組,血清IL-2、IFN-γ水平明顯低于對照組;觀察組發(fā)作期患兒血清IL-1、IL-4、IL-5水平明顯高于緩解期患兒,血清IL-2、IFN-γ水平明顯低于緩解期患兒。分析其原因可能為IL-1是巨噬細胞產(chǎn)生,參與多個免疫反應(yīng),能夠促進氣道內(nèi)中性粒細胞的浸潤,激發(fā)緩激肽引起的氣道高反應(yīng),同時還會增加其他趨化因子的分泌;IL-4、IL-5是Th2分泌的,IL-4可促進IgE的分泌、肥大細胞增長,IL-5可誘導(dǎo)趨化及激活嗜酸粒細胞,結(jié)合上述結(jié)果Th2細胞數(shù)量增加,進而致使哮喘患兒IL-4、IL-5分泌增加;Th1則分泌IL-2、IFN-γ,參與介導(dǎo)細胞免疫過程,是介導(dǎo)Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的重要炎癥因子,上述結(jié)果也提示哮喘患兒中Th1細胞水平降低,因此IL-2、IFN-γ分泌水平也相應(yīng)減少。與多個研究結(jié)果相似[15-17]。

    總之,在3歲以下哮喘患兒中,腸道菌群存在雙歧桿菌水平降低,免疫功能下降,炎癥因子水平異常,調(diào)節(jié)腸道菌群可能會有助于預(yù)防治療3歲以下幼兒哮喘。

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