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    CPB期間靜脈泵注Dex的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況、腦皮質(zhì)組織IL-6表達(dá)變化及其機(jī)制

    2021-01-07 04:46:22張璐謝玉波陳燕樺盧伊芝何芳梁蓓薇
    山東醫(yī)藥 2020年36期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)細(xì)胞腦損傷海馬

    張璐,謝玉波,陳燕樺,盧伊芝,何芳,梁蓓薇

    廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西南寧 530021

    體外循環(huán)(CPB)技術(shù)常用于臨床心內(nèi)直視手術(shù),它的使用大大降低了心臟手術(shù)后患者心肌梗死、心力衰竭等心血管不良事件的發(fā)生率及其他心臟原因相關(guān)病死率[1]。然而研究[2-3]發(fā)現(xiàn),CPB會(huì)對(duì)心臟手術(shù)患者產(chǎn)生神經(jīng)損傷,術(shù)后患者常出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、譫妄、中風(fēng)等現(xiàn)象。右美托咪定(Dex)是一種能高度選擇性激動(dòng)α2腎上腺素能受體的新型藥物,具有一定地中樞抗交感、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用,臨床上常被用做麻醉輔助劑。圍手術(shù)期間泵注Dex可顯著降低CPB心臟手術(shù)后患者出現(xiàn)中風(fēng)和譫妄的概率,且具有腦保護(hù)作用[4]。心臟手術(shù)患兒CPB期間可導(dǎo)致腦血流自動(dòng)調(diào)節(jié)功能受損,海馬神經(jīng)元凋亡及大量炎癥因子釋放,而Dex應(yīng)用于心臟手術(shù)能減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[5-6],但關(guān)于其具體機(jī)制的研究尚少。Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腦損傷后細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和血管生成的基因表達(dá)[7],抑制此通路可加速凋亡過程中神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù),減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量,從而降低腦梗死的大小,改善神經(jīng)功能[8]。2019年9月—2020年3月,我們觀察了體外循環(huán)(CPB)期間靜脈泵注右美托咪定(Dex)的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況、腦皮質(zhì)組織IL-6表達(dá)變化,并探討其機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性成年SPF級(jí)SD大鼠48只,體質(zhì)量300~350 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(桂)2016-0054],所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施完成[SYXK(桂)2016-0037]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[2016(KY-E-002)],并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義的關(guān)懷。

    1.2 藥物、試劑及儀器 Dex(批號(hào):15011032,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);IL-6 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司),TUNEL試劑盒(美國Roche公司),BCA蛋白測(cè)定試劑盒(上海雙螺旋生物科技有限公司),兔抗大鼠pJAK2、pSTAT3單克隆抗體(美國Abcam公司),紅外標(biāo)記的二抗(美國Cell Signaling Technology公司),Western blot一抗、二抗稀釋液(上海碧云天生物科技研究所);小動(dòng)物膜式氧合器(東莞科威公司),體外循環(huán)機(jī)(德國Stockert公司),電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、Dex給藥方法及CPB模型制備 48只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組各16只。①Dex組(D組):在制模前10 min按照5 μg/kg的負(fù)荷劑量靜脈泵注Dex,后制備CPB模型,即大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg),麻醉成功后將大鼠仰臥固定于操作臺(tái)上,運(yùn)用16 G靜脈套管針進(jìn)行經(jīng)口腔氣管插管,設(shè)置小動(dòng)物呼吸機(jī)參數(shù)(潮氣量3 mL/100 g,頻率60次/分),進(jìn)行機(jī)械通氣。大鼠右側(cè)頸前區(qū),左右腹股溝區(qū)常規(guī)剪毛、消毒,后分別行1 cm左右大小切口,用玻璃分針鈍性分離出大鼠右頸外靜脈,右股靜脈和左右股動(dòng)脈,行左股動(dòng)脈穿刺并置入24 G靜脈套管針,用作監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)動(dòng)脈血壓、血?dú)庾兓腿砀嗡鼗幚?,左?cè)股動(dòng)脈穿刺并置入24 G靜脈套管針,用作連接小動(dòng)物膜式氧合器出血端即CPB灌注端,右頸外靜脈穿刺并置入20 G靜脈套管針至右心房,右股靜脈穿刺并置入22 G靜脈套管針,將右頸外靜脈、右股靜脈聯(lián)合用作連接小動(dòng)物膜式氧合器入血端即CPB流出端,轉(zhuǎn)機(jī)開始前經(jīng)左側(cè)股動(dòng)脈注入肝素鈉500 U/kg,若ACT>480 s開始轉(zhuǎn)機(jī),轉(zhuǎn)機(jī)開始后,流出端依靠30 cm左右的重力差引流血液至貯血器,通過滾軸泵入氧合器經(jīng)灌注端回輸,灌注量為100~120 mL/(kg·min),大鼠平均動(dòng)脈血壓維持在75~100 mmHg,整個(gè)CPB環(huán)路無氣泡產(chǎn)生,即模型制備成功。若動(dòng)物模型制備不成功,則選取同種大鼠重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。制模后轉(zhuǎn)機(jī)2 h,轉(zhuǎn)流期間Dex以5 μg/(kg·h)的泵注速度維持。轉(zhuǎn)機(jī)2 h后停CPB。②體外循環(huán)組(C組):建立大鼠CPB模型,模型制備方法參照“①”,制模后轉(zhuǎn)機(jī)2 h,轉(zhuǎn)流期間給予與D組等量生理鹽水。③假手術(shù)組(S組):只作動(dòng)靜脈血管穿刺置管,不轉(zhuǎn)機(jī),給予與D組等量生理鹽水。

    1.4 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用TUNEL法。各組大鼠于CPB轉(zhuǎn)流2 h結(jié)束后立即隨機(jī)取8只,開胸,分離出心臟,剪開心尖部和右心耳,依次經(jīng)升主動(dòng)脈灌注100 mL生理鹽水和4 ℃、4%多聚甲醛,頸椎僵硬后立即剪斷頭部取出腦組織,快速于冰面上分離出海馬,放入4 ℃、4%多聚甲醛中固定24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋后,制成5 μm厚的冠狀切片。參照TUNEL試劑盒步驟進(jìn)行操作,取石蠟切片,依次經(jīng)脫蠟復(fù)水、蛋白酶消化、染色(TUNEL、DAB、蘇木素)、脫水、中性樹脂封片后,光鏡下觀察,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色,且可見棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取海馬CA1區(qū)5個(gè)視野,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

    1.5 大鼠大腦皮質(zhì)組織勻漿上清液IL-6水平檢測(cè) 采用ELISA法。CPB轉(zhuǎn)流2 h結(jié)束后立即處死各組余下的8只大鼠,剪斷頭部,取出腦組織,快速的在冰面上分離出海馬和皮質(zhì),海馬組織保存于-80 ℃冰箱中(用于下述實(shí)驗(yàn)),皮質(zhì)組織用勻漿器充分勻漿,后置于離心機(jī),以3 000 r/min速度離心30 min,吸取上清液,按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)IL-6。

    1.6 大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白檢測(cè) Western blot法。取“1.5”已制備并保存于-80 ℃冰箱中的海馬組織,加入RIPA裂解液和PMSF,使蛋白在冰上充分裂解40 min,后以12 000 r/min速度離心5 min,棄沉淀留上清液。按照BCA法進(jìn)行蛋白定量。分別制備12%分離膠和5%濃縮膠,取60 μg蛋白加入上樣緩沖液(與蛋白比例1∶4),100 ℃變性后,點(diǎn)樣到SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳,PVDF膜先用純甲醇浸泡后放入平衡液中,待電泳完畢后,采用半干法使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST漂洗,加入兔抗大鼠pJAK2單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠pSTAT3單克隆抗體(1∶1 000)和兔抗ACTB多克隆抗體(1∶3 000),4 ℃孵育過夜。TBST漂洗去除未結(jié)合的一抗。加入羊抗兔IgG抗體(1∶10 000),室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參,應(yīng)用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜,采用Imaga J軟件測(cè)定灰度值,以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值表示pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 D、C、S組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為3.93%±0.30%、14.40%±0.18%、3.11%±0.24%,D、S組分別與C組比較,P均<0.05。

    2.2 各組大鼠大腦皮質(zhì)組織勻漿上清液IL-6水平比較 D、C、S組IL-6水平分別為(31.04±0.70)、(47.84±1.33)、(27.99±0.80)pg/100 mg,D、S組分別與C組比較,P均<0.05。

    2.3 各組大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

    表1 各組大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

    3 討論

    CPB對(duì)全身灌注的內(nèi)臟器官產(chǎn)生負(fù)面影響,腦損傷是CPB的常見并發(fā)癥之一[9]。CPB相關(guān)腦損傷可能與炎癥反應(yīng)、腦灌注不足、栓塞等病理生理學(xué)機(jī)制有關(guān),其中炎癥反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和在CPB所致腦損傷的發(fā)展過程中起重要作用,減輕細(xì)胞凋亡和抑制炎癥因子釋放對(duì)CPB期間腦保護(hù)有重要意義[10-11]。研究[12]表明,CPB是非生理性灌注,血液成分與非生物材料接觸引發(fā)炎癥反應(yīng)。

    大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證實(shí),Dex表現(xiàn)出一定地腦保護(hù)作用[13-14]。已有研究報(bào)道,Dex可緩解大鼠創(chuàng)傷性腦損傷,其機(jī)制可能與減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)有關(guān)[15]。WANG等[16]通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,發(fā)現(xiàn)Dex使腦缺血梗死面積明顯縮小,改善認(rèn)知記憶功能障礙以及提高腦缺血后存活率。另外研究證實(shí),Dex的使用可減少異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù),降低活化Caspase-3表達(dá),減輕神經(jīng)毒性[17]。本研究發(fā)現(xiàn),與C組比較,D組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低,大腦皮質(zhì)勻漿上清液IL-6水平降低,提示Dex對(duì)大鼠CPB腦損傷有保護(hù)作用。

    JAK2/STAT3通路是一條細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其可與炎癥因子(如白細(xì)胞介素)間相互調(diào)節(jié)。JAK2通過磷酸化被激活,STAT3作為JAK2的下游因子在JAK2激活后發(fā)生磷酸化[18]。LI等[19]通過建立大鼠CPB循環(huán)模型,發(fā)現(xiàn)海馬組織pJAK2、pSTAT3表達(dá)上調(diào),使用JAK2/STAT3通路特異性拮抗劑能改善CPB大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙。研究證實(shí),抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路能減輕腦缺血再灌注損傷所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn),與S組比較,C組大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高;與C組比較,D組海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低;上述結(jié)果提示,Dex可能通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活對(duì)CPB大鼠腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

    總之,CPB期間靜脈泵注Dex可減輕大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦部炎癥,機(jī)制可能與其可抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

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