miR-24-3p靶向PDCD5減輕缺氧/復氧誘導心肌細胞損傷的作用機制

鄭鳳龍 任喜尚 楊潔

(鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學系，河南 鄭州 450064)

急性心肌梗死(AMI)的青年患者數(shù)量逐年遞增，且男性患者比例較大〔1〕。AMI幸存患者1年后的發(fā)病率和死亡率仍高于普通人群〔2〕，而AMI的治療會引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，如何避免和減輕MIRI是臨床亟需解決的問題，也是AMI臨床研究的熱點。研究表明，miRNA在心臟病和心力衰竭等過程中也存在調(diào)控作用，miRNA可能通過改變關鍵的信號分子，為MIRI提供潛在的治療靶點和心肌損傷標志物〔3，4〕。MiR-24主要功能是調(diào)節(jié)細胞生長與凋亡，參與細胞分化及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔5〕。研究表明，心肌梗死后miR-24在心肌組織中表達降低，抑制梗死后心肌細胞的凋亡，改善心肌功能〔6〕。程序化細胞死亡因子(PDCD)5是一種促凋亡基因，在H2O2處理的心肌細胞中表達上調(diào)〔7〕。但兩者在心肌細胞中的作用機制尚不清楚。本課題以大鼠心肌細胞H9c2為研究對象，建立缺氧/復氧(H/R)模型，研究 miR-24-3p對H/R誘導H9c2細胞損傷、凋亡的分子機制，探討PDCD5在此機制中的作用，為MIRI的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細胞H9c2購自ATCC；胎牛血清(FBS)和高糖/低糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；抗PDCD5、抗Bcl-2、抗Bax和抗Cleaved-caspase-3抗體購自Abcam公司；雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；流式細胞儀購自BD公司，光學顯微鏡、全自動酶標儀及Real-time PCR儀購自美國bio-rad公司。

1.2細胞培養(yǎng) 在含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)H9c2細胞，置于37℃、5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度95%。待細胞生長至對數(shù)生長期時，洗滌消化傳代。

1.3細胞H/R模型構(gòu)建和實驗分組 H/R模型建立：將低糖無血清DMEM培養(yǎng)基置于37℃ 低氧密閉培養(yǎng)箱中，以2 L/min的流速通入95%N2和5%CO2混合氣體，持續(xù)通入4 h充分飽和培養(yǎng)基，用上述培養(yǎng)基快速置換培養(yǎng)至對數(shù)生長期的H9c2高糖培養(yǎng)基，細胞于低氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，然后將培養(yǎng)液更換為10%FBS的高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h復氧。

實驗分組：對照組：37℃、5% CO2、95%空氣恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；H/R組：按照模型建立的方法進行培養(yǎng)，缺氧3 h后復氧4 h；實驗組：轉(zhuǎn)染48 h后進行H/R模型建立。

1.4細胞轉(zhuǎn)染 用培養(yǎng)液稀釋對數(shù)生長期的H9c2細胞，以每孔2×105個細胞接種于6孔板中，細胞融合為一層時進行轉(zhuǎn)染，用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine2000和各組載體后取脂質(zhì)體與等體積載體輕柔混勻，室溫孵育15 min，將混合液滴入培養(yǎng)好的細胞中，混合均勻，培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h，進行后續(xù)實驗。

1.5Real-time PCR檢測RNA表達 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組H9c2細胞，用試劑盒提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，測定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照 real-time PCR說明書進行反應，miR-24-3p上游引物為5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′，下游引物為5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′；PDCD5 上 游 引 物 為5′-CCATGGCGGACGAGGAGCTTG-3′，下 游 引 物 為5′-TCAATAATCGTCATCTTCATC-3′；反應程序為：95℃ 4 min，95℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃ 10 min。運用IQ5TM real-time PCR 檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)進行數(shù)據(jù)分析。

1.6流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率 收集處理好的各組H9c2細胞，接種于6孔板中(2×105個細胞/孔)，培養(yǎng)24 h，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，稀釋細胞濃度為1×106個/ml，根據(jù)凋亡試劑盒說明書進行操作，取100 μl標記緩沖液重懸細胞，然后加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光20 min，流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 將轉(zhuǎn)染后的H9c2細胞進行收集，Trypsin消化細胞后稀釋，以2×104個細胞/孔接種于24孔板中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，若細胞融合為一層時進行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建PDCD5的野生型(WT-PDCD5)和突變型(MUT-PDCD5)雙熒光素酶報告載體，分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-24-3p。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞室溫裂解20 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，檢測上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.8Western印跡檢測PDCD5和凋亡相關蛋白 收集培養(yǎng)好的H9c2細胞，加入裂解液孵育20 min，冰浴超聲破碎細胞，收集蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(抗PDCD5抗體 1∶1 000，抗Bcl-2抗體1∶500，抗Bax抗體1∶1 000，抗Cleaved-caspase-3抗體1∶1 000)，4℃孵育過夜，PBST洗膜2次，加入稀釋的二抗(PDCD5二抗1∶1 500，Bcl-2二抗1∶100，Bax二抗1∶1 000，Cleaved-caspase-3二抗1∶1 000)室溫孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H/R處理對心肌細胞中miR-24-3p和PDCD5表達的影響 與對照組相比，H/R組心肌細胞中miR-24-3p表達量顯著下降(P<0.05)，PDCD5 mRNA和蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 PDCD5蛋白表達

表1 H/R處理對心肌細胞中miR-24-3p和PDCD5表達的影響

2.2miR-24-3p過表達對心肌細胞中LDH、SOD活性和MDA含量的影響 qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，H/R組miR-24-3p表達量顯著下降(P<0.05)，與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組miR-24-3p表達量顯著上升(P<0.05)。細胞損傷測定結(jié)果顯示，與對照組相比，H/R組細胞中LDH和MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組LDH和MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.3miR-24-3p過表達可抑制心肌細胞凋亡 與對照組相比，H/R組凋亡相關蛋白Bcl-2表達量顯著下降(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3表達量顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組凋亡相關蛋白Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3表達量顯著下降(P<0.05)，細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖2，表3，圖3。

表2 miR-24-3p過表達對心肌細胞中LDH、SOD活性和MDA含量的影響

圖2 miR-24-3p過表達對心肌細胞凋亡的影響

表3 miR-24-3p過表達對心肌細胞凋亡的影響

圖3 各組凋亡相關蛋白表達

2.4抑制PDCD5表達對心肌細胞損傷的影響 與對照組相比，H/R組PDCD5蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡相關蛋白Bcl-2表達量顯著下降(P<0.05)，Bax表達量顯著上升(P<0.05)，細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，細胞中LDH和MDA含量顯著增多(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與H/R+si-NC組相比，H/R+si-PDCD5組PDCD5蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，凋亡相關蛋白Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)，Bax表達量顯著下降(P<0.05)，細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，細胞中LDH和MDA含量顯著減少(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見圖4，表4。

2.5miR-24-3p靶向調(diào)控PDCD5的表達 Targetscan軟件預測結(jié)果顯示，PDCD5的3′UTR序列中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列，見圖5。雙熒光素酶報告系統(tǒng)所示，與miR-NC組(1.03±0.08、0.98±0.07)相比，miR-24-3p組WT-PDCD5螢火蟲熒光素酶相對活性(0.42±0.03)顯著下降(t=17.488，P=0.000)；而MUT-PDCD5螢火蟲熒光素酶相對活性(1.04±0.09)沒有明顯變化(t=1.289，P=0.226)。Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組(0.49±0.05)相比，miR-24-3p組PDCD5表達量(0.18±0.03)顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.50±0.05)相比，anti-miR-24-3p組的PDCD5表達量(0.88±0.08)顯著上升(P<0.05)。見圖6。

表4 抑制PDCD5表達對心肌細胞損傷的影響

圖5 PDCD5的3′UTR中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列

圖6 Western印跡檢測PDCD5蛋白表達

2.6PDCD5過表達逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-24-3p對心肌細胞損傷的作用 與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組PDCD5蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，細胞中LDH和MDA含量顯著減少(P<0.05)，SOD活性顯著上升(P<0.05)，凋亡相關蛋白Bcl-2表達量顯著上升(P<0.05)，Bax表達量顯著下降(P<0.05)，細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)；與H/R+miR-24-3p+pcDNA組相比，H/R+miR-24-3p+pcDNA-PDCD5組PDCD5蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，細胞中LDH和MDA含量顯著增多(P<0.05)，SOD活性顯著下降(P<0.05)，凋亡相關蛋白Bcl-2表達量顯著下降(P<0.05)，Bax表達量顯著上升(P<0.05)，細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。見圖7，表5。

圖7 PDCD5和凋亡相關蛋白表達

表5 PDCD5過表達逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-24-3p對心肌細胞損傷的作用

3 討 論

社會老年化的加劇和工作壓力的增大，AMI發(fā)病率越來越高，且呈年輕化趨勢，預計2030年AMI患者將接近2 300萬〔8〕。治療過程中產(chǎn)生的MIRI損傷可導致永久性殘疾或死亡，如何減輕AMI幸存者的MIRI損傷是臨床主要問題，目前尚無具體的靶向治療策略，研究MIRI的治療方式是這一領域研究的熱點〔9〕。

miRNA如miR-1、miR-21、 miR-29、miR-92a、miR-101、 miR-499等通過調(diào)控心肌細胞、心肌成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等的增殖和凋亡，參與心臟發(fā)育、心肌重塑、心律失常和心力衰竭等生物過程〔10，11〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-24 參與心肌細胞的凋亡作用，益氣逐瘀方通過上調(diào)大鼠缺血心肌組織中的miR-24表達，減輕心肌梗死大鼠的心肌損傷和心肌細胞凋亡〔12〕。溫明華〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，遠端缺血預適應誘導的外泌體能夠通過傳遞miR-24至細胞中下調(diào)促凋亡蛋白Bim表達，從而減輕氧化應激處理后H9c2細胞的凋亡。Xiao等〔14〕發(fā)現(xiàn)，miR-24-3p在缺血/再灌注(I/R)的心肌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-24-3p可通過激活Nrf2-Keap1途徑保護心肌細胞免受I/R損傷誘導的體外心肌細胞凋亡。Tan等〔15〕發(fā)現(xiàn)，在心肌I/R損傷小鼠模型中，miR-24-3p下調(diào)，miR-24-3p可通過抑制RIPK1，從而在心肌I/R損傷中發(fā)揮心臟保護作用。本研究也證實，miR-24-3p在H/R處理后的心肌細胞H9c2細胞中表達顯著下降，與Xiao等〔14〕和Tan等〔15〕研究結(jié)果一致，過表達miR-24-3p可減輕H/R對H9c2細胞的損傷，提高細胞抗氧化能力，抑制細胞凋亡，驗證了miR-24-3p在H/R誘導的心肌損傷中發(fā)揮重要作用。

PDCD5原名TFAR19，最初是由我國學者從白血病細胞株TF-1中克隆得到，位于染色體19q12-q13.1，與P53、C-myc、Bcl-2和Bax等基因參與細胞凋亡的調(diào)控過程〔16，17〕。而任安立等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，H/R損傷的H9c2細胞中，PDCD5表達水平升高，沉默PDCD5可抑制核因子(NF)-κB信號通路，進而抑制H/R損傷誘導的心肌細胞凋亡和自噬。周鳳華等〔19〕研究表明，I/R模型組大鼠心肌中PDCD5表達量顯著升高，中藥定心方可抑制PDCD5表達，激活ERK通路，減輕心肌損傷。Zhang等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，在異丙腎上腺素誘導的小鼠中，過表達PDCD5可誘導自噬和抑制凋亡進而改善心臟功能和抑制由異丙腎上腺素誘導的心臟重塑。本研究與任安立等〔18〕和周鳳華等〔19〕研究結(jié)果一致；抑制PDCD5表達可減輕H/R對H9c2細胞的損傷，提高細胞抗氧化能力，抑制細胞凋亡，驗證了PDCD5在MIRI損傷中的作用。

此外，通過Targetscan軟件預測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDCD5的3′UTR中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列，預示miR-24-3p與PDCD5可能存在結(jié)合位點或某種調(diào)控關系。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果也顯示，miR-24-3p靶向負調(diào)控PDCD5的表達，過表達PDCD5可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-24-3p對H/R誘導的H9c2細胞損傷的作用，即miR-24-3p通過下調(diào)PDCD5表達減輕H/R誘導的心肌細胞H9c2損傷，抑制細胞凋亡，驗證了兩者在心肌細胞中存在調(diào)控關系。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，在H/R處理的大鼠心肌細胞H9c2中，miR-24-3p通過靶向抑制PDCD5表達進而減輕H/R誘導的心肌細胞H9c2損傷，抑制心肌細胞凋亡。另外，上調(diào)miR-24-3p可能通過抑制RIPK1和PDCD5，激活Nrf2-Keap1和ERK通路，抑制NF-κB信號通路，達到減輕H/R誘導的心肌細胞H9c2損傷，抑制心肌細胞凋亡的作用。

綜上，miR-24-3p有望成為心肌細胞MIRI損傷分子治療的新靶點，對患者MIRI損傷治療和提高患者生存質(zhì)量具有重要指導意義。