長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5通過調(diào)控miR-196b-5p抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖侵襲遷移的機(jī)制

劉向前 趙天增 楊金華

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普胸外科，河南 南陽 473000)

肺癌是全世界人類最常見的一種癌癥，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占90%〔1,2〕。由于NSCLC的發(fā)病隱秘，臨床上大多確診患者已至晚期，已錯(cuò)過最佳治療時(shí)期，其預(yù)后5年生存率不足16%〔3～5〕。目前靶向治療在很多癌癥中均為最有效的治療方法，因此尋找新的NSCLC分子治療靶標(biāo)具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過200 nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其在NSCLC的診斷、治療中均具有重要作用〔6,7〕。LncRNA GAS5在NSCLC的研究中已證實(shí)為異常升高的致癌因子〔8,9〕，但其在NSCLC中具體的作用機(jī)制尚未十分清楚。miR-196b-5p在多種癌癥中均出現(xiàn)表達(dá)異常升高〔10～12〕，包括NSCLC，但其在NSCLC中的調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚。

本研究將以NSCLC細(xì)胞A549為研究對(duì)象，檢測(cè)細(xì)胞中LncRNA GAS5和miR-196b-5p的表達(dá)，觀察過表達(dá)LncRNA GAS5、抑制miR-196b-5p、過表達(dá)miR-196b-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，揭示其機(jī)制可能與miR-196b-5p靶向負(fù)調(diào)控LncRNA GAS5有關(guān)，將為NSCLC的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 NSCLC細(xì)胞A549、肺支氣管正常細(xì)胞16HBE購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶均購自美國(guó)GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自德國(guó)羅氏公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Promega公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購自美國(guó)Coming公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞A549、肺支氣管正常細(xì)胞16HBE，置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將miR-196b-5p 模擬物(mimics)、miR-NC、miR-196b-5p 抑制劑(inhibitor)、anti-miR-NC、anti-miR-196b-5p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-GAS5按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書要求轉(zhuǎn)染至A549，分別標(biāo)記為miR-196b-5p組、miR-NC組、miR-196b-5p inhibitor組、anti-miR-NC組、anti-miR-196b-5p組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-GAS5組；pcDNA3.1-GAS5分別與miR-NC、miR-196b-5p mimics用同樣的方法共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，標(biāo)記為pcDNA3.1+miR-NC組、pcDNA3.1-GAS5+miR-196b-5p組，轉(zhuǎn)染24 h后，用qRT-PCR檢測(cè)。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) Trizol法提取組織樣本或?qū)?shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞樣本總RNA,并進(jìn)行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求進(jìn)行操作，合成模板鏈cDNA。按照qRT-PCR試劑盒反應(yīng)體系要求進(jìn)行操作，反應(yīng)結(jié)束后通過分析Ct值，計(jì)算定量結(jié)果，以2-△△Ct法計(jì)算miR-196b-5p的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn) RIPA蛋白裂解液對(duì)研磨組織或?qū)?shù)期細(xì)胞進(jìn)行冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于無菌新EP管中，加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。然后離心，進(jìn)行電泳，再用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5% 脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃室溫孵育2 h。加入發(fā)光液，曝光，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白GAS5的表達(dá)。

1.6MTT實(shí)驗(yàn) 取適量1.3各組細(xì)胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)3.5 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞的增殖與吸光值呈正比。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn) 將1.3各組細(xì)胞以106個(gè)/孔接種于細(xì)胞6孔板，培養(yǎng)至融合度80%時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。調(diào)整細(xì)胞密度至105個(gè)/ml，取100 μl加入上室內(nèi)，600 μl含血清的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。將Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，然后按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將熒光素酶報(bào)告載體(psiCHECK2-GAS5-WT，psiCHECK2-GAS5-MUT)分別與miR-196b-5p mimics、miR-NC用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，培養(yǎng)4 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書操作步驟要求操作。結(jié)果以海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反映miR-196b-5p與GAS5的結(jié)合力。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA GAS5和miR-196b-5p在A549細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中的表達(dá) A549細(xì)胞LncRNA GAS5的表達(dá)較16HBE細(xì)胞顯著降低(2.11±0.26 vs 4.36±0.41，P<0.05)，miR-196b-5p表達(dá)較16HBE細(xì)胞顯著升高(3.67±0.31 vs 1.06±0.16，P<0.05)。

2.2過表達(dá)GAS5對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 pcDNA3.1-GAS5組與pcDNA3.1組比較，GAS5表達(dá)顯著升高，在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 過表達(dá)GAS5對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.3過表達(dá)GAS5對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響 pcDNA3.1-GAS5組與pcDNA3.1組比較細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 過表達(dá)GAS5對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響個(gè))

2.4抑制miR-196b-5p對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 如表3所示，miR-196b-5p inhibitor組與miR-NC組比較細(xì)胞中miR-196b-5p表達(dá)顯著降低，在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞遷移量顯著降低，細(xì)胞侵襲量顯著降低(均P<0.05)。

2.5LncRNA GAS5調(diào)控miR-196b-5p的表達(dá) 通過Target scan對(duì)可能與miR-196b-5p結(jié)合的GAS5進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p與GAS5存在互補(bǔ)序列(圖1)。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，與miR-NC組相比，miR-196b-5p 組WT-GAS5細(xì)胞的熒光活性顯著降低，MUT-GAS5細(xì)胞的熒光活性不受影響。見表4。

表3 抑制miR-196b-5p表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

圖1 LncRNA GAS5與miR-196b-5p的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6過表達(dá)miR-196b-5p逆轉(zhuǎn)了GAS5對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 如表5所示，pcDNA3.1-GAS5組與pcDNA3.1組比較miR-196b-5p表達(dá)顯著降低，在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)顯著降低；pcDNA3.1-GAS5+miR-196b-5p組與pcDNA3.1-GAS5+miR-NC組比較miR-196b-5p表達(dá)顯著升高，在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05)。過表達(dá)miR-196b-5p逆轉(zhuǎn)了GAS5對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

表5 過表達(dá)miR-196b-5p逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)GAS5對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

3 討 論

LncRNA具有組織特異性，且可以穩(wěn)定存在于人的體液和組織中，這些優(yōu)勢(shì)使其成為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物〔13,14〕。研究證實(shí)，LncRNA在NSCLC中的表達(dá)異常升高，如X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本基因(XIST)、低氧誘導(dǎo)因子1α的反義核糖核酸(HIF1A-AS1)、肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1〔15,16〕。Liang等〔17〕對(duì)NSCLC患者手術(shù)前后血液中的GAS5進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血液中GAS5的表達(dá)顯著降低，術(shù)后1 w患者血清中GAS5的水平顯著升高，提示GAS5可作為臨床診斷NSCLC的生物標(biāo)志物。張學(xué)軍等〔18〕在NSCLC的研究中闡明，GAS5在NSCLC中低表達(dá)，且其表達(dá)量與NSCLC的惡性程度呈正相關(guān)，預(yù)示著LncRNA GAS5有望成為NSCLC的預(yù)后標(biāo)志物。Tan等〔19〕用qRT-PCR檢測(cè)NSCLC組織和血液中GAS5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中GAS5明顯降低，術(shù)后急劇增加，推測(cè)GAS5可用于NSCLC的早期診斷和手術(shù)治療后的患者監(jiān)測(cè)。本研究運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)了NSCLC細(xì)胞A549中GAS5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，GAS5低表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果均相一致；又用MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了過表達(dá)GAS5的A549細(xì)胞的增殖遷移侵襲發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GAS5可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

微小RNA(miRNA)被認(rèn)為是基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，并且在各種癌癥中作為致癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮關(guān)鍵作用〔20〕。Li等〔21〕通過qRT-PCR、蛋白免疫印跡分析在NSCLC中檢查miR-196b和GATA-6的表達(dá)，Transwell測(cè)定細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)現(xiàn)，miR-196b在NSCLC組織和細(xì)胞中均為高表達(dá)，且過表達(dá)miR-196b促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，抑制miR-196b則表現(xiàn)出相反的效果，GATA6被證實(shí)是NSCLC細(xì)胞中miR-196b的特異性靶標(biāo)，GATA6可減弱miR-196b調(diào)節(jié)的NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲，提示miR-196b通過下調(diào)GATA6增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲，表明miR-196b具有診斷和治療NSCLC的潛力。Yu等〔22〕在NSCLC的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-196b的表達(dá)水平異常上調(diào)，且上調(diào)miR-196b可喪失細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，刺激細(xì)胞侵襲和細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧忓N體形狀，而同源框(HOX)A9在NSCLC中的表達(dá)與miR-196b呈負(fù)相關(guān)，且HOXA9為miR-196b的靶標(biāo)，HOXA9可減弱鋅指2(SNAI2/SLUG)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9的表達(dá)，揭示了miR-196b可以作為開發(fā)抗癌劑的潛在靶標(biāo)。本研究檢測(cè)了NSCLC細(xì)胞中miR-196b-5p的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，且抑制miR-196b-5p可顯著降低A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，這與前人的研究結(jié)果相吻合；深入研究，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-196b-5p靶向負(fù)調(diào)控GAS5，且過表達(dá)miR-196b-5p可逆轉(zhuǎn)GAS5對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

綜上所述，GAS5可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，其機(jī)制可能與直接負(fù)向調(diào)控miR-196b-5p有關(guān)，為NSCLC的治療提供了新靶點(diǎn)。