西紅花苷基于Wnt/β-catenin信號通路改善阿爾茨海默病大鼠的空間記憶

林玲 劉國良 楊麗娜 高麗

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 1生理學(xué)教研室，河南 鄭州 451191；2預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室)

阿爾茨海默病(AD)已經(jīng)成為繼心血管疾病、癌癥、腦卒中之后的第四大死亡殺手〔1〕，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但其病因及發(fā)病機(jī)制目前并不十分清楚。研究表明，β淀粉樣蛋白(Aβ)的異常沉積及老年斑(SP)的形成在AD的發(fā)病中起著非常重要的作用〔2〕。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路由Wnt蛋白、Wnt受體、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成激酶(GSK)-3β等蛋白構(gòu)成，Wnt蛋白是重要的啟動因子，β-catenin和GSK-3β蛋白是該通路的核心成分,該通路參與了多種細(xì)胞的增殖、分化和遷移，同時(shí)影響神經(jīng)元軸突導(dǎo)向、樹突發(fā)育和突觸形成〔3〕。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路可調(diào)節(jié)突觸的可塑性〔4〕，與學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)〔5〕,該通路功能紊亂與AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔6,7〕。西紅花苷對AD大鼠的空間記憶能力顯著改善〔8,9〕，但其作用機(jī)制并不十分清楚。西紅花苷是否可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而改善AD大鼠的空間記憶，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究西紅花苷對AD模型大鼠空間記憶能力及海馬CA1和CA3突觸小泡蛋白(SYP)的表達(dá)和Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，探討西紅花苷對AD大鼠空間記憶的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物及分組 成年雄性SD大鼠(清潔級)，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，體重180～220 g，合格證號：SCXK湘2016-0003。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為三組：正常對照組、AD模型組、西紅花苷組，每組18只。

1.2主要藥品和試劑 西紅花苷標(biāo)準(zhǔn)品購自南京景竹生物科技有限公司(批號：04238-00-3)，兔多克隆抗SYP、GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin抗體均購自Abcam公司，Aβ25～35購自Sigma公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、Alexa Fluor ?488標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗GAPDH均購自碧云天生物科技有限公司(上海)。

1.3主要儀器 Morris水迷宮(北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，SN-2大鼠腦立體定位儀(安徽正華科技有限公司)，微量注射泵(成都泰盟科技有限公司)，冰凍切片機(jī)(Leica公司，德國)，熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(六一儀器廠，北京)。

1.4方法

1.4.1AD模型大鼠的制備與給藥 各組大鼠用8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(10 ml/kg)，立體定位儀上依據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》定位右側(cè)腦室，前囟后0.8 mm,旁開1.8 mm,顱骨表面向下3.5 mm，微量注射器緩慢將5 μl Aβ25～35注射進(jìn)入側(cè)腦室構(gòu)建AD模型大鼠，留針30 min 防止液體外溢，術(shù)后皮膚縫合，皮膚切開處滴加青霉素抗感染。術(shù)后次日AD+西紅花苷組每天固定時(shí)間腹腔注射西紅花苷(40 mg/kg)，AD模型組和正常對照組注入等量的生理鹽水，連續(xù)14 d。

1.4.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組空間記憶能力 西紅花苷末次給藥24 h之后進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，大鼠于固定象限面向池壁入水，記錄大鼠在120 s 內(nèi)找到水下平臺的時(shí)間即為潛伏期，訓(xùn)練進(jìn)行5 d，每日2次，每次訓(xùn)練時(shí)間間隔15 min，訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變。第6天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越原平臺的次數(shù)。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，AD模型組潛伏期短于正常對照組潛伏期平均值者，說明造模不成功，予以剔除，并補(bǔ)充造模，120 s內(nèi)未找到平臺的大鼠也予以剔除。

1.4.3免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測各組海馬SYP的表達(dá) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉后經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌注后迅速取出腦組織,經(jīng)梯度酒精脫水，石蠟包埋,冠狀位切成片厚3 μm 薄片,用免疫組化(SP法)檢測各組海馬CA1區(qū)SYP蛋白的表達(dá)：切片經(jīng)脫蠟、水洗、0.3% H2O2封閉處理，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次×5 min，經(jīng)微波抗原修復(fù)后加入10%牛血清蛋白(BSA)封閉。加入抗SYP一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS 漂洗3次×5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫(25℃)孵育2 h,PBS漂洗3次×5 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡拍片，應(yīng)用Image J圖像分析軟件測定海馬CA1和CA3陽性細(xì)胞平均積分光密度。

1.4.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測各組海馬SYP的表達(dá) 各組麻醉、灌流、固定、取材步驟同1.4.3，冰凍切片機(jī)上對海馬組織作連續(xù)冠狀切片，厚度15 μm，切片經(jīng) 0.01 mol/L PBS 漂洗3次×5 min，然后再用0.3% TritonX-100通透2 h，10% BSA封閉1 h，處理好的腦片加入兔抗SYP多克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育48 h;復(fù)溫后0.01 mol/L PBS漂洗,暗室加入Alexa Fluor?488標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS 漂洗3次×5 min，防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image J圖像分析軟件檢測海馬CA1和CA3區(qū)SYP陽性細(xì)胞平均積分光密度。

1.4.5Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組海馬SYP、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β蛋白的表達(dá) 各組最后6只大鼠麻醉后快速取出全腦,分離出海馬,提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，加5×十二烷基苯磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液,100℃變性10 min。每孔加入20 μg 蛋白，Tris-SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳1 h，恒流恒壓濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PDVF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h,分別加入兔多克隆抗大鼠SYP(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、p-β-catenin(1∶1 000)、GSK3β(1∶1 000)抗體,4℃過夜，TBST洗膜3次×5 min。分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔甘油二抗,室溫下2 h；TBST洗膜3次,每次15 min；電光學(xué)發(fā)光(ECL)法對蛋白條帶進(jìn)行曝光，以GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件測定各蛋白條帶的灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力比較 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，AD模型組空間記憶能力明顯減退：逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短(P<0.01)；穿越原平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.01)。與AD模型組比較，西紅花苷組空間記憶能力明顯增強(qiáng)：逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)；目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(P<0.01)；穿越原平臺的次數(shù)明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測各組海馬SYP表達(dá) 相比于正常對照組,AD模型組SYP的表達(dá)顯著減少，平均積分光密度顯著減弱(P<0.01)；相比于AD模型組，西紅花苷組SYP的表達(dá)顯著增多，平均積分光密度顯著增強(qiáng)(P<0.05)。見圖1，表2。

表2 免疫組化實(shí)驗(yàn)各組大鼠海馬CA1和CA3 SYP平均積分光密度(IOD)的比較

2.3免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測各組海馬SYP表達(dá) 相比于正常對照組，AD模型組SYP陽性細(xì)胞平均積分光密度顯著減弱(P<0.01)；相比于AD模型組，西紅花苷組SYP陽性細(xì)胞積分光密度顯著增強(qiáng)(P<0.05)。見圖2，表3。

2.4Western印跡檢測各組海馬SYP、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β蛋白表達(dá) 相比于正常對照組，AD模型組海馬SYP、β-catenin的表達(dá)均明顯減少(均P<0.01)，p-β-catenin、GSK3β的表達(dá)均明顯增加(均P<0.01)；與AD模型組比較,西紅花苷組SYP、β-catenin的表達(dá)均明顯增加(均P<0.05)，p-β-catenin、GSK3β的表達(dá)明顯減少(均P<0.05)。見圖3，表4。

圖2 各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)SYP的表達(dá)(DAB，×200)

表3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)各組大鼠海馬CA1和CA3SYP 平均積分光密度(IOD)的比較

1～3：正常對照組，AD模型組，西紅花苷組

表4 各組大鼠海馬SYP、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β蛋白平均積分光密(IOD)的比較

3 討 論

西紅花，又名藏紅花，是鳶尾科番紅花屬多年生球莖早本植物，其藥用部分為其花柱的干燥柱頭，具有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、降血壓、抗神經(jīng)元凋亡、改善學(xué)習(xí)記憶等藥理作用〔10,11〕。既往研究表明，西紅花苷可通過激活腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)-TrkB信號通路，對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶有顯著改善〔12,13〕，40 mg/kg及80 mg/kg劑量對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的治療作用明顯優(yōu)于20 mg/kg劑量組，且40 mg/kg與80 mg/kg在作用效果無顯著差異〔8,9〕，故本實(shí)驗(yàn)選取40 mg/kg為治療劑量，不再設(shè)置其他給藥劑量。

SYP是位于突觸前膜囊泡上的一種特異性鈣結(jié)合蛋白，是突觸可塑性的特異性標(biāo)志物，與學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)〔12,13〕。研究表明，SYP表達(dá)增加，可改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔14〕。本研究結(jié)果表明， 西紅花苷可以通過增加AD大鼠海馬CA1和CA3區(qū)SYP的表達(dá)改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

研究發(fā)現(xiàn)，在不同的AD動物模型中，均發(fā)現(xiàn)有Wnt/β-catenin信號通路的抑制或損傷〔15〕，而激活該通路，則可通過對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)而對AD學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，比如，姜黃素可通過激活該通路，增減Wnt3a和β-catenin的表達(dá)，改善AD學(xué)習(xí)記憶〔16〕,石杉堿也可以通過激活該通路抑制Aβ的沉積，進(jìn)而改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔17〕。Aβ的聚集是AD的核心病變〔18〕，本實(shí)驗(yàn)中，外源性的 Aβ在大鼠腦內(nèi)過多的集聚，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，并對Wnt/β-catenin信號通路產(chǎn)生明顯影響，導(dǎo)致β-catenin磷酸化并向胞核聚集，進(jìn)而抑制糖原合成激酶(GSK)3β的磷酸化。導(dǎo)致GSK3β的活性增加，進(jìn)而引起Tau蛋白的過度磷酸化，并對神經(jīng)細(xì)胞的正常功能造成嚴(yán)重影響。Western印跡實(shí)驗(yàn)表明，與正常對照組比較，AD模型組p-β-catenin和GSK3β的表達(dá)明顯增加，β-catenin的表達(dá)明顯減少；與AD模型組比較，西紅花苷組β-catenin的表達(dá)明顯增加，p-β-catenin和GSK3β的表達(dá)明顯減少。分析其原因，可能是利用西紅花苷進(jìn)行干預(yù)治療后，Wnt/β-catenin信號通路被激活，進(jìn)而抑制β-catenin蛋白的磷酸化，GSK3β磷酸化增強(qiáng)，對神經(jīng)元的正常生理功能進(jìn)行保護(hù)，最終使AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)。

綜上所述，西紅花苷可以激活Wnt/β-catenin信號通路，使β-catenin的磷酸化增強(qiáng)，GSK3β的表達(dá)減少，增加突觸可塑性分子SYP的表達(dá)，進(jìn)而改善AD大鼠的空間記憶能力。