香煙煙霧刺激誘導(dǎo)肺動脈高壓動物模型的構(gòu)建

孫得勝 劉虹延 劉先勝 歐陽瑤

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563003；2針灸科；3華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點實驗室)

肺動脈高壓作為常見的肺血管疾病，以顯著的肺動脈壓增高為主要特征，它也是多種慢性呼吸系統(tǒng)疾病的并發(fā)癥及多種疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另外，它也是相關(guān)疾病患者病情加重和死亡的重要原因之一。作為常見的肺血管疾病，肺動脈高壓的特點是肺動脈及右心室收縮壓力增高，常常引起右心功能不全，預(yù)后很差〔1～5〕。 它往往存在著肺遠端小血管的重塑，并因此引起血管阻力升高，常伴右心室肥大，甚至造成嚴(yán)重的右心力衰竭〔6,7〕。吸煙者容易發(fā)生肺動脈高壓〔8〕，而且有研究顯示〔9～11〕，不少吸煙的慢性阻塞性肺疾病患者在患病初期，未發(fā)生明顯缺氧時已存在肺小血管重塑。從而說明香煙煙霧能夠直接造成肺小血管重塑〔9〕。構(gòu)建有效的肺動脈高壓疾病模型是深入研究肺動脈高壓的發(fā)病機制，并進一步為臨床工作提供參考依據(jù)的前提。 在大鼠肺動脈高壓模型實驗中，通常采用低氧干預(yù)、野百合堿誘導(dǎo)及外科操作分流等方法。本研究以單純香煙煙霧刺激4個月的方法建立疾病模型，以右心導(dǎo)管的方法檢測大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)、取肺組織制作病理切片來檢測肺血管重塑程度等方法，旨在研究和探討這一種方法制作肺動脈高壓疾病模型的可行性，為今后深入探討肺動脈高壓的發(fā)病機制提供研究平臺。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠(共20只)，鼠齡8 w，體重200～220 g，從武漢同濟醫(yī)院實驗動物中心購買。造模、測壓及取材等操作在武漢同濟醫(yī)院實驗動物中心內(nèi)進行。

1.2主要儀器與試劑 香煙煙霧暴露染毒系統(tǒng)(自主研發(fā)，專利號ZL201820234399.3)；PowerLab 生物數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(ADInstruments公司)；石蠟切片機(MEDITE公司)；4℃低溫冰箱(中國海爾公司)；Motic image圖像系統(tǒng)(麥克奧迪有限公司)；香煙(煙堿量0.6 mg、焦油含量9 mg、一氧化碳量11 mg 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)；多聚甲醛(塞維爾公司)；蘇木素染液(塞維爾公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，拜意爾生物公司)。

1.3實驗方法

1.3.1模型的建立 把大鼠用隨機數(shù)字表法分為：對照組(n=9)和肺動脈高壓模型(模型)組(n=11)。肺動脈高壓模型組大鼠在染毒箱〔12〕內(nèi)接受香煙煙霧暴露，每天2次，連續(xù)造模4個月。監(jiān)測染毒箱里面的氧氣濃度，控制箱內(nèi)氧氣濃度在18%～21%。同時，使染毒箱里面的一氧化碳濃度維持在900 ppm左右。滿4個月時檢測右心室收縮壓，然后取肺組織并進一步制作病理切片，檢測肺血管重塑程度。

1.3.2檢測血流動力學(xué)指標(biāo) 參考相關(guān)文獻的方法進行〔13，14〕。常規(guī)麻醉大鼠后，行氣管插管，連接小動物呼吸機機械通氣。設(shè)置好潮氣量、呼吸頻率等參數(shù)后，剪開大鼠體表皮膚及皮下組織后，以右心導(dǎo)管測壓，待示波波形穩(wěn)定后，由PowerLab 軟件分析。

1.3.3計算右心室肥厚指數(shù) 將大鼠心室中的血液放盡后，將心臟分離為右心室、左心室+室間隔兩部分，在干燥程度基本一致的條件下稱量，并計算心室肥厚指數(shù)。比較兩組間的右心室重量的差異。

1.3.4肺組織標(biāo)本留取及檢測 將大鼠的右肺上葉以多聚甲醛固定，并進一步制作石蠟切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色以中膜厚度的差異比較兩組大鼠的肺血管重塑程度。所有獨立的實驗至少重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 與對照組相比，模型組大鼠活動減少，毛發(fā)較為枯黃。造模過程中，模型組死亡3只，對照組有1只大鼠肺組織切片見嚴(yán)重肺炎征象，因此未納入分析。

2.2右室收縮壓 與對照組相比，模型組右心室收縮壓顯著增高。參考國際上的研究共識〔1,5,15〕，可認(rèn)為本實驗中肺動脈高壓模型成立。見圖1、表1。

圖1 右室收縮壓波形圖

表1 兩組各指標(biāo)比較

2.3右心室肥厚程度 模型組大鼠的右心室重量、右心室重量/體重和右心室肥厚指數(shù)，均比對照組明顯升高，提示模型組大鼠的右心室肥厚程度明顯加重。見表1。

2.4肺血管重塑的觀察 將HE切片放大200倍，觀察那些直徑在50～150 μm的血管。以中膜厚度比作為衡量指標(biāo)，模型組肺血管管壁的厚度顯著增加。見表1、圖2。

圖2 肺血管重構(gòu)水平(HE，×200)

3 討 論

肺動脈高壓的發(fā)病機制目前尚不清楚，它分為五大類，不同類的肺動脈高壓在病因和診療方法也有許多差異。在肺動脈高壓的研究領(lǐng)域，目前常用的動物造模方法主要有野百合堿誘導(dǎo)、缺氧誘導(dǎo)(聯(lián)合或不聯(lián)合SU5416)、手術(shù)分流等方法〔15～19〕。隨著煙草相關(guān)疾病越來越受到關(guān)注，香煙煙霧能否直接引起肺動脈高壓成為該領(lǐng)域的研究熱點〔9,20〕

既往研究多注意到長期吸煙者存在慢性缺氧，而缺氧可引起肺血管收縮和肺血管重構(gòu)，從而認(rèn)為此情況下肺動脈高壓的發(fā)生是繼發(fā)或伴發(fā)于慢性阻塞性肺疾病〔21〕。然而，不少研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧的刺激功能能夠在不缺氧時，直接造成肺血管的重構(gòu)，繼而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展〔9～11〕。

在本研究中使染毒箱氧氣濃度維持在18%～21%，和空氣中的氧濃度接近，因此可排除環(huán)境缺氧這一因素對本模型的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)單純的香煙煙霧作用4個月后，大鼠的右心室收縮壓明顯升高，右心室收縮壓在科研中常用來反映肺動脈收縮壓，故表明該模型順利造成。肺動脈高壓組的右心室肥厚程度顯著加重，肺血管重塑水平也明顯增加，提示以香煙煙霧刺激的方法建立的肺動脈高壓動物模型中，肺動脈高壓的形成可能與肺血管重塑及右心室肥厚有關(guān)，具體的機制尚待進一步研究。