鮮、干延胡索藥材中生物堿和核苷類成分的含量差異

楊 勤，谷文超，祁俊生，沈 力，周 濃*

(1. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120；2. 重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404000；3. 大理大學(xué)藥學(xué)院，大理 671000)

延胡索又稱元胡，為罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang)的干燥塊莖，性辛、苦、溫，具有活血行氣止痛等功效，為我國傳統(tǒng)道地藥材“浙八味”之一[1-2]。延胡索適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)地廣泛，自然分布在江蘇、安徽、浙江、湖北等地區(qū)，后被陜西、四川、重慶等地區(qū)引種栽培[3-4]。延胡索含有豐富的化學(xué)成分，如生物堿、多糖、核苷、酚酸、蒽醌類化合物等[5-7]。其中生物堿作為其主要的化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)痛、抗心律失常，抗腫瘤等多種臨床活性[8-10]。劉珍珍等[11]通過研究水煮、水蒸、醋煮、鹽煮4種加工方法對延胡索中5種生物堿含量的影響，發(fā)現(xiàn)這4種加工方法得到的5種生物堿總量由高到低依次為水蒸>水煮>醋煮>鹽煮。余平等[12]對延胡索不同部位生物堿含量進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)延胡索表皮生物堿含量最高，去皮延胡索生物堿含量最低。張靜等[13]通過研究不同產(chǎn)地延胡索中的6種生物堿含量差異，發(fā)現(xiàn)生物堿的含量受產(chǎn)地因素影響較大，其品質(zhì)表現(xiàn)出一定的地域環(huán)境依賴性，并且商品等級對生物堿的含量無顯著影響。核苷類成分具有降壓、保肝、調(diào)節(jié)免疫功能、抗心律失常等多種生物活性[14]，延胡索中的核苷類成分與其生物活性具有一定關(guān)聯(lián)性，因此也可作為延胡索質(zhì)量評價指標(biāo)之一[15]。

鮮藥一般是指未經(jīng)任何可能導(dǎo)致藥材成分改變或損失的處理的“原生藥材”，即在藥材采收后使用的中藥原料[16]，是中醫(yī)藥和民族藥特色之一，具有氣味正、質(zhì)量好等特點(diǎn)。干藥是鮮藥經(jīng)一定的加工處理后，水分及揮發(fā)性成分流失后的藥材，其特點(diǎn)是能長期保存，便于運(yùn)輸。研究表明，鮮藥與干藥有效成分及藥理藥效具有一定差異[17]。陳莉萍等[18]比較了鮮、干馬齒莧藥材品質(zhì)及抗菌作用的差異性，發(fā)現(xiàn)鮮馬齒莧中的總黃酮質(zhì)量濃度高于干馬齒莧，且鮮馬齒莧的抗菌作用明顯優(yōu)于干馬齒莧。朱南南等[19]對鮮、干金釵石斛的化學(xué)成分及抗氧化活性進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)金釵石斛鮮品的總生物堿和多糖含量及其對羥自由基的清除率和抗氧化能力均顯著高于干品。目前，對于延胡索鮮、干藥材的有效成分差異性研究未見報道。本研究采用HPLC法，對8個產(chǎn)地鮮、干延胡索藥材中的6種生物堿和3種核苷進(jìn)行對比分析，明確鮮延胡索與干延胡索品質(zhì)的差異，為延胡索干、鮮品的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(LC-20A型號，日本島津公司；1260型號，美國安捷倫公司)；萬分之一分析天平(CP225D型號，德國Sartorius公司)；超聲波清洗機(jī)(SB-5200DTN型號，寧波新芝生物科技股份有限公司)；多管架自動平衡離心機(jī)(TDZ5-WS型號，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 藥材來源與處理

延胡索新鮮塊莖采集于重慶、浙江、江蘇、陜西和安徽5個省市8個不同產(chǎn)地種植大戶，每份樣品均取自50株成熟植株塊莖以保證樣品代表性，由重慶三峽學(xué)院周濃教授鑒定為罌粟科植物延胡索(C.yanhusuoW. T. Wang)塊莖，樣品信息見表1。

新采集的延胡索藥材經(jīng)洗凈，去雜，晾干水分后，切碎混勻并采用四分法進(jìn)行分樣，取對角線的2份樣品勻漿處理后得延胡索鮮藥材，剩余樣品于45℃干燥箱中烘至恒重，粉碎過50目篩得延胡索的干藥材。鮮藥材中有效成分含量為折干率折算后的數(shù)據(jù)，各產(chǎn)地延胡索折干率見表1。

表1 樣品來源

1.2.2 試驗(yàn)試劑

原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110853-201003、110732-201309、110713-201212、110726-210213、120928-201208)；鹽酸黃連堿、脫氫紫堇堿對照品(成都曼思特生物科技有限公司，純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計算大于98%)；尿苷、腺苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110887-200202，110879-200202)；鳥苷對照品(南京都萊生物技術(shù)有限公司，純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計算大于98%，批號961-07-9)；色譜用乙腈、甲醇(色譜純，德國默克公司)；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 生物堿類的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥至恒重的原阿片堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿和延胡索乙素對照品適量，加甲醇溶解制成濃度分別為0.538、0.518、0.435、0.560、0.500、0.590 mg/mL混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取“1.2.1”延胡索新鮮和干燥藥材各1.0 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液20 mL，浸泡1 h，超聲提取40 min，放冷，過濾，濾液加70%甲醇定容至25 mL，搖勻，即得。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Durashell C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A(乙腈)-B(0.2%冰醋酸溶液，三乙胺調(diào)節(jié)pH=5.05)，梯度洗脫：0～15 min，20% A；15～35 min，20%～80% A；檢測波長：280 nm；體積流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35℃[13]。按照上述色譜條件進(jìn)行分析，各成分分離度良好，對照品和樣品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)及S16樣品(B)的HPLC圖譜Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed standard sample solution(A) and sample(B)

2.1.4 結(jié)果與分析

由表2可以看出，8個不同產(chǎn)地鮮、干延胡索中的生物堿含量具有顯著性差異(P<0.05)，其中原阿片堿含量在0.126 8～0.351 3 mg/g之間，鹽酸黃連堿含量在0.342 8～1.149 0 mg/g之間，鹽酸巴馬定含量在0.028 4～0.320 7 mg/g之間，鹽酸小檗堿含量在0.023 5～0.109 3 mg/g之間，脫氫紫堇堿含量在0.075 8～1.228 4 mg/g之間，延胡索乙素含量在0.265 9～0.655 8 mg/g之間。8個產(chǎn)地中，S16(重慶市開縣大德鎮(zhèn)九嶺村延胡索干品)生物堿總量最高，含量為3.124 9 mg/g。根據(jù)含量比可以看出，6種生物堿含量大小總體表現(xiàn)為鹽酸黃連堿>延胡索乙素>原阿片堿>脫氫紫堇堿>鹽酸巴馬汀>鹽酸小檗堿，其中干品延胡索中的原阿片堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿含量均大于鮮品，而鮮品延胡索中的延胡索乙素大于干品，原因可能是烘干過程中延胡索乙素部分被分解。

表2 不同產(chǎn)地延胡索鮮品和干品中生物堿的含量

續(xù)表2 不同產(chǎn)地延胡索鮮品和干品中生物堿的含量

2.2 核苷類的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥至恒重的尿苷、鳥苷、腺苷對照品適量，加純凈水溶解并制成質(zhì)量濃度分別為1.212、0.804、1.200 mg/mL的對照品貯備液。取各對照品貯備液適量，加純凈水定容至10 mL制成混合對照品溶液，各核苷類質(zhì)量濃度分別為242.40、160.80、120.00 μg/mL。并逐級稀釋，得到一系列不同質(zhì)量濃度的3種核苷混合對照品溶液，置于4℃的冰箱內(nèi)，臨用前以0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取“1.2.1”延胡索新鮮和干燥藥材各1.0 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，稱定重量，混勻，密封，室溫下超聲30 min(300 W，40 kHz)，取出，放至室溫，用水補(bǔ)足減失重量，倒入離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上清液以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得

2.2.3 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A(甲醇)-B(水)，梯度洗脫：0～10 min，1%～5% A；10～15 min，5%～15% A；15～22 min，15%～17% A；22～26 min，17%～20% A；26～32 min，20%～24% A。檢測波長：260 nm；體積流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35℃[15]。按照上述色譜條件進(jìn)行分析，各成分分離度良好，對照品和藥材色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品(A)及S14樣品(B)的HPLC圖譜Fig. 2 Mixed reference(A) and S14 sample's of C. yanhusuo(B) HPLC

2.2.4 結(jié)果與分析

由表3可以看出，8個不同產(chǎn)地鮮、干延胡索中的核苷含量具有顯著性差異(P<0.05)，尿苷含量在0.021 4～0.178 2 mg/g之間，鳥甘含量在0.020 0～0.194 4 mg/g之間，腺苷含量在0.033 5～0.165 4 mg/g之間。8個產(chǎn)地中S14(安徽省蕪湖縣花橋鎮(zhèn)苗育村延胡索干品)核苷總量最高，為0.572 8 mg/g，并且8個產(chǎn)地延胡索干品中的3種核苷含量均大于鮮品。延胡索鮮品中3種核苷含量大小依次為腺苷>尿苷>鳥苷，而干品中大小依次為尿苷>鳥苷>腺苷，表明在烘干過程中核苷含量變化明顯，結(jié)合表3數(shù)據(jù)可以看出，尿苷和鳥苷變化較大，腺苷含量變化較小。

表3 不同產(chǎn)地延胡索鮮品和干品中核苷的含量

2.3 相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件對不同產(chǎn)地鮮、干延胡索中的6種生物堿和3種核苷進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。從表4可以看出生物堿與核苷之間存在一定的相關(guān)性，其中鹽酸巴馬汀與尿苷、鳥苷呈極顯著正相關(guān)(r=0.664，0.704，P<0.01)，與腺苷呈顯著正相關(guān)(r=0.585，P<0.05)；鹽酸小檗堿與鳥苷呈極顯著正相關(guān)(r=0.627，P<0.01)，與尿苷、腺苷呈顯著正相關(guān)(r=0.592，r=0.503，P<0.05)；脫氫紫堇堿與尿苷、鳥苷呈極顯著正相關(guān)(r=0.720，0.769，P<0.01)，與腺苷呈顯著正相關(guān)(r=0.583，P<0.05)；延胡索乙素與尿苷、鳥苷、腺苷呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.608，-0.625，-0.588，P<0.01)。各生物堿之間也存在一定相關(guān)性，原阿片堿與延胡索乙素呈極顯著正相關(guān)(r=0.624，P<0.01)；鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿呈極顯著正相關(guān)(r=0.935，0.925，P<0.01)；鹽酸小檗堿與脫氫紫堇堿呈極顯著正相關(guān)(r=0.885，P<0.01)。同時，各核苷之間也具有一定相關(guān)性，尿苷與鳥苷、腺苷呈極顯著正相關(guān)(r=0.990，0.948，P<0.01)，鳥苷與腺苷呈極顯著正相關(guān)(r=0.926，P<0.01)。

表4 不同產(chǎn)地延胡索鮮品和干品各成分間相關(guān)性矩陣

2.4 聚類分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件對不同產(chǎn)地鮮、干延胡索中的生物堿含量和核苷含量作為指標(biāo)分別進(jìn)行聚類分析，采用系統(tǒng)聚類中的Ward法，選取平方Euclidean距離作為樣品度量的標(biāo)準(zhǔn)，繪出樹狀圖，結(jié)果詳見圖3、4。從圖3可以看出，以6種生物堿為指標(biāo)，當(dāng)Euclidean距離為20時，可將16個樣品分為兩類：第I類包括S2、S5、S6、S8、S11、S12、S14、S16，此類樣品多為干品，生物堿總量較多。第II類包括S1、S3、S4、S7、S9、S10、S13、S15，此類樣品多為延胡索鮮品，生物堿總量相對較少。從圖4可以看出，當(dāng)Euclidean距離為20時，也將16個樣品分為兩類：第I類包括S2、S12、S14、S16，這類樣品均為延胡索干品，核苷總量豐富。第II類包括S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S13、S15，這類樣品包含延胡索干品和鮮品?？偟膩砜矗煌a(chǎn)地延胡索分類交叉嚴(yán)重，有效成分含量差異性較大，干品延胡索有效成分含量顯著。

圖3 生物堿聚類圖Fig. 3 Alkaloid cluster

圖4 核苷聚類圖Fig. 4 Nucleoside cluster

3 討 論

研究表明，新鮮藥材在干制過程中，化學(xué)成分的種類和含量會發(fā)生明顯變化。除水分的流失外，許多藥材在干制過程中其易揮發(fā)性成分和易氧化或易分解的成分均有程度不同的損失[20]。本研究結(jié)果表明，干品延胡索中5種生物堿含量(原阿片堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿)和3種核苷含量(尿苷、鳥苷、腺苷)均大于鮮品，表明延胡索在烘干過程中，鮮品中的水分被蒸干，而以上8種有效成分損失較小，在藥材質(zhì)量相同的情況下，干品延胡索中的生物堿和核苷含量均大于鮮品。而對于延胡索乙素，其作為延胡索中最重要的生物堿之一，在2020版《中國藥典》中是延胡索“含量測定”項(xiàng)下的指標(biāo)性成分[1]。研究表明，延胡索乙素是延胡索的主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛、催眠、降低冠脈阻力及增加血流量等作用[21]。本研究中，鮮品延胡索的延胡索乙素含量大于干品，原因是延胡索乙素不穩(wěn)定，受光熱作用易分解[22]，在干制過程中延胡索乙素分解嚴(yán)重，因而鮮品延胡索中延胡索乙素含量較高。8個產(chǎn)地延胡索干品中，S6(江蘇省通州區(qū)張芝鎮(zhèn)啟橋村)、S12(浙江省磐安縣尚湖鎮(zhèn)小坑門)延胡索乙素含量符合2020年版《中國藥典》一部中延胡索(元胡)藥材項(xiàng)下“含量測定”的限定標(biāo)準(zhǔn)(按干燥品計算，延胡索乙素不得少于0.05%)[1]，其余產(chǎn)地延胡索干品均不符合。

本研究結(jié)果表明，8個產(chǎn)地的延胡索生物堿和核苷含量均具有顯著性差異(P<0.05)，表明產(chǎn)地不同，延胡索有效成分含量差異性較大，與安艷等[23]對不同產(chǎn)地延胡索產(chǎn)量品質(zhì)研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析結(jié)果表明，延胡索中各有效成分之間具有不同程度的相關(guān)性。6種生物堿中，除鹽酸黃連堿與其他有效成分無顯著相關(guān)性，其余成分之間均具有顯著相關(guān)性。聚類分析結(jié)果表明，干品延胡索分在第I類，鮮品延胡索多分在第II類，結(jié)合有效成分含量，干、鮮品差異性較大，干品延胡索中有效成分總量較高。

本研究對8個不同產(chǎn)地鮮、干延胡索藥材中的6種生物堿和3種核苷進(jìn)行對比分析，比較了鮮品延胡索與干品延胡索品質(zhì)的差異，為延胡索藥材的系統(tǒng)開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。