• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃芪甲苷對多囊卵巢綜合征大鼠性激素水平及氧化應激損傷的影響*

    2021-01-06 08:26:56李艷青傅金英牛小斌
    中國病理生理雜志 2020年12期
    關鍵詞:甲苷性激素卵泡

    李艷青,趙 方,傅金英△,高 蕊,吳 昕,牛小斌

    (1河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦科,河南鄭州 450003;2河南中醫(yī)藥大學研究生處,河南鄭州 450046;3河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科,河南鄭州 450003)

    多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一種常見的婦科內分泌疾病,其臨床表現為持續(xù)性無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變及胰島素抵抗[1]。PCOS 的病因復雜,發(fā)病機理尚不明確,但有研究顯示,PCOS 患者較正常人體內的氧化應激(oxidative stress,OS)水平明顯升高[2-3],提示OS可能是PCOS發(fā)病的潛在誘因,從抗氧化的角度認識該疾病可能會發(fā)現新的治療靶點。目前臨床治療PCOS 多以對癥治療為主(如達英-35 和氟他胺等),但療效有限且副作用大[4]。而中醫(yī)藥治療PCOS 療效溫和持久且不良反應少,已成為近些年的研究熱點[5]。

    黃芪甲苷(astragaloside,AST)是一種從黃芪上提取出來的高純度藥物,具有免疫調節(jié)、器官保護、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及改善胰島素抵抗活性等多種生物活性[6-7]。由于黃芪甲苷含量少、效果好,藥效強度是黃芪多糖的2 倍以上而享有“超級黃芪多糖”的美稱,但目前尚無黃芪甲苷在治療PCOS 方面的報道。本研究擬通過來曲唑誘導建立PCOS 大鼠模型,觀察黃芪甲苷對PCOS 大鼠血清性激素、氧化應激水平及卵巢組織形態(tài)學的影響,探討其對PCOS 大鼠性激素水平和氧化應激損傷的影響,為黃芪甲苷治療PCOS提供實驗基礎。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 實驗動物 SPF 級雌性SD 大鼠60 只,6~7 周齡,體質量(180±20)g,由河南省實驗動物中心提供,合格證號SCXK(豫)2017-0002。大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心,室內溫度(22±2)℃,相對濕度50%~70%。

    1.2 主要試劑 黃芪甲苷(成都科程生物科技開發(fā)有限公,批號20180512);來曲唑片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號16113061);達英-35(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號333A);蘇木素-伊紅(HE)染色液(蘇州卡爾文生物科技有限公司);大鼠性激素睪酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2),促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激素(folliclestimulating hormone,FSH)ELISA 試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)試劑盒(南京建成生物工程研究所);甾類激素合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenetic acute regulatory pro?tein,StAR)、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax 和GAPDH抗體(Abcam,批號分別為ab-13897、ab-60232、ab-173054、ab-181602 和ab-186517);過氧化物酶標記羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司,批號BST12E27C55)。

    1.3 儀器 680 型酶標儀(Bio-Rad);TKY-BMC 石蠟包埋機(湖北泰康醫(yī)療設備有限公司);RM2235切片機(Leica);DYCZ-24DN 型電泳儀和DYCZ-40D 型轉膜儀(北京六一儀器廠);Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics)。

    2 方法

    2.1 動物造模及分組處理 將60 只大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后,隨機分成正常對照(control)組、模型組(model)組、陽性對照達英-35(Diane-35)組,黃芪甲苷低劑量(low dose of AST,AST-L)組和黃芪甲苷高劑量(high dose of AST,AST-H)組,每組12 只。PCOS 造模方法參考前期研究[8],具體操作為將1 mg/kg 來曲唑溶于質量分數1%的羧甲基纖維素(car?boxylmethyl cellulose,CMC)溶液中,連續(xù)灌胃21 d,制備PCOS 模型,其中正常對照組給予等量1%CMC灌胃。于造模第16 天開始對大鼠進行1 個周期(5 d)的陰道涂片觀察動情周期,若陰道上皮細胞持續(xù)角化為造模成功[9]。造模成功后開始灌胃給藥,根據前期預實驗結果,黃芪甲苷低劑量組和黃芪甲苷高劑量組大鼠分別給予12.5 mg/kg 和50 mg/kg 黃芪甲苷灌胃,而達英-35 組大鼠給予0.339 2 mg/kg 達英-35[9]灌胃,對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)3周。

    2.2 陰道涂片觀察大鼠動情周期 實驗期間每天早上9 點用蘸有生理鹽水的無菌棉簽緩慢插入大鼠陰道,輕輕地在大鼠陰道內旋轉2 圈并將其順時針均勻地涂在載玻片上,行陰道涂片后自然干燥,蘇木素染色,于顯微鏡下觀察細胞種類和形態(tài),同時觀察大鼠陰道口徑的變化及充血狀態(tài),結合陰道涂片檢查結果,判斷大鼠性周期的各個時期。

    2.3 計算卵巢指數 末次給藥后,摘取雙側卵巢和雙角子宮,用鑷子仔細分離并去除臟器表面脂肪組織,濾紙吸拭表面,用分析電子天平稱量質量。卵巢指數=兩側卵巢總質量(mg)/大鼠體質量(g)。

    2.4 HE 染色觀察卵巢組織病理學變化 摘取各組大鼠左側卵巢組織,放入4%多聚甲醛中固定24 h,經脫水處理后進行常規(guī)石蠟包埋,制作3~4 μm 石蠟切片,行HE 染色,于顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)并拍照。

    2.5 ELISA 檢測血清中性激素含量 取各組大鼠血清,按照試劑盒說明書進行操作,采用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的A值,根據標準曲線計算血清中T、E2、LH和FSH的含量。

    2.6 比色法檢測血清及卵巢組織中SOD、MDA 和GSH-Px 水平 取血清及卵巢組織稱質量,組織碾磨至勻漿,4℃、10 000×g離心15 min,取上清液。按照試劑盒操作說明書加入相應試劑,孵育后測各樣品吸光度值,根據試劑盒說明書提供的計算公式分別計算MDA和GSH-Px含量及SOD活性。

    2.7 Western blot檢測 稱取適量卵巢組織,加入裂解液充分研磨后置于冰浴中勻漿,然后在4℃、10 500×g條件下離心20 min,收集上清液,BCA 法測定上清液中蛋白含量。取等量蛋白樣品進行SDSPAGE,隨后轉移至PVDF 膜,用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min,洗膜,加入Ⅰ抗(StAR、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 和GAPDH 抗體均1∶1 000 稀釋),4℃搖床過夜,次日加入HRP標記的Ⅱ抗,室溫孵育1 h,最后使用ECL 顯色。利用ImageJ 圖像分析軟件進行分析,結果用灰度值表示,以目的條帶與GAPDH 的灰度值比值,作為目的蛋白表達的相對水平。

    3 統(tǒng)計學處理

    通過SPSS 22.0 軟件進行處理,結果以均數±標準差(meas±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 黃芪甲苷對PCOS模型大鼠動情周期的影響

    如表1 所示,對照組大鼠動情周期正常有規(guī)律;模型組大鼠動情周期紊亂,動情期消失,動情前期時間延長,說明PCOS 大鼠模型構建成功;黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠大部分處于動情期,周期恢復規(guī)律;黃芪甲苷低劑量組大鼠大部分仍處于動情前期階段,動情期大鼠較少。

    表1 各組大鼠動情周期比較Table 1.Comparison of the estrous cycles of rats in each group(n=12)

    2 黃芪甲苷對PCOS模型大鼠卵巢指數的影響

    如表2 所示,與對照組比較,模型組大鼠卵巢指數顯著增加(P<0.05);與模型組比較,黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢指數顯著減少(P<0.05),而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化(P>0.05)。

    3 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠卵巢組織病理結構的影響

    如圖1 所示,對照組大鼠卵巢表面色澤偏紅,表面可見黃體,未見囊狀擴張卵泡;模型組和黃芪甲苷低劑量組大鼠卵巢體積變大,表面蒼白,少見黃體,可見多個囊狀擴張卵泡;黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢體積變小,表面色澤較紅潤可見黃體,囊狀卵泡擴增不明顯。

    4 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠血清性激素水平的影響

    如表3 所示,與對照組比較,模型組大鼠血清中T 和LH 含量顯著增加(P<0.05),E2和FSH 含量顯著減少(P<0.05);與模型組比較,黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠血清中T 和LH 含量顯著減少(P<0.05),E2和FSH 含量顯著增加(P<0.05);而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化(P>0.05)。

    表2 各組大鼠卵巢指數比較Table 2.Comparison of the ovarian index of rats in each group(mg/g.Mean±SD. n=12)

    5 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠血清及卵巢組織中氧化應激水平的影響

    如表4 和表5 所示,與對照組比較,模型組大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量顯著增加(P<0.05),GSH-Px和SOD 活性顯著降低(P<0.05);與模型組比較,黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量顯著減少(P<0.05),GSH-Px 和SOD 活性顯著升高(P<0.05),而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化(P>0.05)。

    Figure 1.Pathological changes of ovarian tissue sections(HE staining,scale bar=50 μm).A:control group;B:model group;C:Diane-35 group;D:AST-L group;E:AST-H group.The ovaries of rats in groups B and D were enlarged,with pale sur?face,rare corpus luteum,and multiple cystic dilated follicles.圖1 各組大鼠卵巢組織切片病理觀察

    表3 各組大鼠血清性激素水平比較Table 3.Comparison of serum levels of sex hormones in rats(Mean±SD. n=12)

    6 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠卵巢組織中StAR 及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

    如圖2 和表6 所示,與對照組比較,模型組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著上調(P<0.05),Bcl-2 蛋白水平顯著下調(P<0.05);與模型組比較,黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著下調(P<0.05),Bcl-2 蛋白水平顯著上調(P<0.05),而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化(P>0.05)。

    表4 各組大鼠血清中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比較Table 4.Comparison of the levels of MDA,GSH-Px and SOD in serum of rats in each group(Meas±SD. n=12)

    表5 各組大鼠卵巢組織中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比較Table 5.Comparison of the levels of MDA,GSH-Px and SOD in ovarian tissue of rats in each group(Mean±SD. n=12)

    Figure 2.The protein expression of StAR,cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 in ovarian tissue detected by Western blot.圖2 Western blot 檢測卵巢組織中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

    討 論

    OS 是由于機體自由基產生過多,自身清除自由基的能力下降,導致機體氧化和抗氧化失衡而引發(fā)的組織損傷。OS 不僅在慢性炎癥、腫瘤、老化及各種代謝性疾病中發(fā)揮著重要作用,也與PCOS的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]。有研究報道[11],OS 損傷可導致卵泡發(fā)育受損、成熟障礙和卵泡閉鎖;同時也有研究提出[12],OS 可增強卵巢雄激素相關合成酶StAR 的表達,刺激雄性激素的產生和釋放,從而導致PCOS 發(fā)生。這些研究提示OS 可能是PCOS 的發(fā)病機制之一,減輕OS 可能是PCOS 治療的潛在方法。黃芪甲苷作為傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分,具有抗氧化、抗炎、擴血管和改善心腦缺血性疾病等作用[13],但黃芪甲苷是否對PCOS 造成的氧化應激損傷以及性激素水平有一定的作用,尚未見報道。本研究結果顯示,黃芪甲苷能通過下調PCOS大鼠機體的氧化應激水平,抑制StAR 的表達,調節(jié)血清性激素水平,減少卵巢組織細胞凋亡,從而發(fā)揮對PCOS模型大鼠的保護作用。

    PCOS 是一種常見的排卵障礙性疾病,其卵泡發(fā)育異常主要表現為過多的早期卵泡生長。本研究結果顯示,PCOS 模型大鼠動情周期紊亂,卵巢指數顯著增加,卵巢組織形態(tài)學觀察結果表明,模型大鼠卵巢內可見較多囊狀擴張卵泡,未見黃體,提示無排卵,與臨床PCOS 患者病理表現相符[14],說明本研究成功建立了來曲唑誘導的PCOS大鼠模型,該模型的核心病理機制可能是由于卵泡不能發(fā)育成熟和卵泡壁的過度增生不能破裂,導致卵泡閉鎖造成的。給與高劑量黃芪甲苷治療后,模型大鼠動情周期恢復規(guī)律性變化,卵巢指數趨于正常,卵巢內少見囊狀擴張卵泡,黃體有所恢復,提示黃芪甲苷能夠顯著改善PCOS 模型大鼠的排卵狀況。正常生理狀態(tài)下卵泡的生長發(fā)育在多種性激素的調控下精密有序地進行,包括T、LH、E2和FSH[15]。PCOS 患者通常表現出復雜的內分泌異常,其中以高血清T 和LH 以及低血清E2和FSH 為主要特征[16-17]。本研究結果顯示,PCOS 大鼠血清T 和LH 含量顯著增加,而E2和FSH含量顯著減少,與前人研究一致。而給與高劑量黃芪甲苷治療后,模型大鼠血清T 和LH 含量下降,E2和FSH 含量回升,說明黃芪甲苷能夠顯著平衡PCOS模型大鼠的血清激素水平。

    表6 各組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達水平Table 6.Relative protein expression levels of StAR,cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 in rat ovarian tissue in each group(Meas±SD. n=12)

    OS 被認為是PCOS 的潛在誘因,OS 能加重高雄激素的發(fā)生,而高雄激素血癥被認為是PCOS的典型特征之一[18]。MDA 是脂質過氧化產物,可反映機體氧化損傷的程度;SOD 和GSH-Px 是兩種主要的抗氧化劑,在維持機體的氧化-抗氧化動態(tài)平衡中起著重要作用,可將其作為抗氧化能力的檢測指標。本研究結果顯示,PCOS模型大鼠血清及卵巢組織中均出現MDA 含量明顯升高,GSH-Px 和SOD 活性明顯降低的現象,與Seyyed 等[19]的研究結果一致,表明OS確實參與PCOS 進程的調控。高劑量黃芪甲苷治療后,PCOS 大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量明顯下調,GSH-Px 和SOD 活性明顯上升,提示黃芪甲苷治療能有效改善其氧化應激水平。卵泡顆粒細胞參與了卵巢卵泡的發(fā)育、成熟、閉鎖及卵巢性激素的正常分泌過程,其凋亡被認為是PCOS卵泡退化的根本原因[20]。本研究結果顯示,PCOS 模型大鼠卵巢組織中cleaved caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著上調,Bcl-2 蛋白顯著下調,而高劑量黃芪甲苷治療能逆轉這類凋亡蛋白的表達變化,說明黃芪甲苷能減少卵巢細胞的凋亡,改善PCOS癥狀。為進一步明確黃芪甲苷改善PCOS氧化應激損傷的具體靶點,本研究對各組大鼠卵巢組織中StAR 蛋白表達水平進行了檢測,研究結果顯示,模型組大鼠卵巢組織中StAR 蛋白表達明顯增加,高劑量黃芪甲苷處理后StAR 蛋白表達顯著減少。提示黃芪甲苷可通過抑制OS發(fā)生,減少StAR的表達,調節(jié)性激素水平,從而改善PCOS。

    綜上所述,黃芪甲苷可通過發(fā)揮抗OS 功效,下調StAR 蛋白表達,調節(jié)血清性激素水平,緩解卵巢增生程度和病理改變,從而發(fā)揮對來曲唑致PCOS模型大鼠的保護和調節(jié)作用,為黃芪甲苷應用于治療PCOS提供了實驗基礎。

    猜你喜歡
    甲苷性激素卵泡
    肺動脈高壓與性激素相關性研究進展
    為什么要做性激素檢查
    促排卵會加速 卵巢衰老嗎?
    小鼠竇前卵泡二維體外培養(yǎng)法的優(yōu)化研究
    為什么要做性激素檢查
    曲美他嗪聯合黃芪甲苷對心力衰竭犬心肌細胞Ca2+水平的影響
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:12:05
    卵巢卵泡膜細胞瘤的超聲表現
    慢性焦慮刺激對成年雌性大鼠性激素水平的影響
    黃芪甲苷對特發(fā)性肺纖維化模型大鼠肺組織CD34表達的影響
    卵泡的生長發(fā)育及其腔前卵泡體外培養(yǎng)研究進展
    科技視界(2014年29期)2014-08-15 00:54:11
    成在线人永久免费视频| 在线观看午夜福利视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久精品91蜜桃| 国产高清激情床上av| 日韩视频一区二区在线观看| 性少妇av在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲性夜色夜夜综合| 久9热在线精品视频| 久久伊人香网站| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 嫩草影院精品99| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费在线观看影片大全网站| 天堂动漫精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成人欧美| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜老司机福利片| 美女福利国产在线| 亚洲成人久久性| 午夜免费观看网址| 中文欧美无线码| 国产精品一区二区在线不卡| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 丰满的人妻完整版| 欧美精品一区二区免费开放| 怎么达到女性高潮| 亚洲专区中文字幕在线| 黑丝袜美女国产一区| 三级毛片av免费| 国产精品电影一区二区三区| 老司机靠b影院| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精华国产精华精| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品免费视频内射| 亚洲,欧美精品.| 最近最新免费中文字幕在线| 高清在线国产一区| 午夜两性在线视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 一进一出抽搐动态| 91九色精品人成在线观看| 亚洲全国av大片| 久久香蕉国产精品| 两人在一起打扑克的视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲avbb在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 久久性视频一级片| 丁香六月欧美| 91成人精品电影| 亚洲九九香蕉| 午夜久久久在线观看| 手机成人av网站| 在线观看一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产激情久久老熟女| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日本欧美视频一区| 久久久久久久久久久久大奶| 9色porny在线观看| 好男人电影高清在线观看| 99国产精品免费福利视频| 黄片大片在线免费观看| 一级毛片女人18水好多| 国产野战对白在线观看| 在线看a的网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 99国产精品一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 电影成人av| 成人18禁在线播放| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| a级毛片在线看网站| 黄色片一级片一级黄色片| 91精品国产国语对白视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久国产精品麻豆| 老司机午夜十八禁免费视频| 岛国在线观看网站| 一区福利在线观看| 制服诱惑二区| 国产伦一二天堂av在线观看| avwww免费| 亚洲精华国产精华精| 制服人妻中文乱码| 老司机靠b影院| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费高清视频大片| 色婷婷av一区二区三区视频| a级毛片黄视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 又大又爽又粗| 真人做人爱边吃奶动态| 国产又色又爽无遮挡免费看| 香蕉国产在线看| 亚洲色图综合在线观看| 国产三级在线视频| 中亚洲国语对白在线视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日本免费a在线| 高清av免费在线| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲第一青青草原| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲精品av麻豆狂野| 97碰自拍视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产片内射在线| 在线观看www视频免费| 国产午夜精品久久久久久| 精品一区二区三区四区五区乱码| 激情在线观看视频在线高清| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一进一出抽搐动态| 免费日韩欧美在线观看| 免费高清视频大片| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产黄a三级三级三级人| 精品一区二区三区四区五区乱码| 手机成人av网站| 岛国视频午夜一区免费看| 中文字幕人妻熟女乱码| 香蕉久久夜色| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 一级毛片精品| av在线播放免费不卡| 嫁个100分男人电影在线观看| 一级毛片女人18水好多| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 真人一进一出gif抽搐免费| 91在线观看av| 18禁国产床啪视频网站| 免费在线观看黄色视频的| av电影中文网址| 久热这里只有精品99| 在线观看免费日韩欧美大片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久人人精品亚洲av| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 俄罗斯特黄特色一大片| 91大片在线观看| 自线自在国产av| а√天堂www在线а√下载| 久久久久精品国产欧美久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 精品一区二区三区av网在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 最近最新免费中文字幕在线| 99国产精品99久久久久| 久久精品国产清高在天天线| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 女性被躁到高潮视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久这里只有精品19| a级毛片黄视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 天天添夜夜摸| 久久久久久久久免费视频了| 国产又爽黄色视频| 午夜免费激情av| 美女福利国产在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久草成人影院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品一区二区在线不卡| 男女午夜视频在线观看| 两性夫妻黄色片| av电影中文网址| 亚洲激情在线av| bbb黄色大片| 激情在线观看视频在线高清| 久久久精品欧美日韩精品| 国产激情久久老熟女| 午夜视频精品福利| 视频在线观看一区二区三区| 又黄又粗又硬又大视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品久久电影中文字幕| 久久人人精品亚洲av| 十八禁人妻一区二区| 中文字幕高清在线视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 性少妇av在线| 不卡一级毛片| 1024视频免费在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美激情极品国产一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产亚洲欧美在线一区二区| xxx96com| 国产野战对白在线观看| 99热国产这里只有精品6| 岛国在线观看网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 99精品在免费线老司机午夜| a级片在线免费高清观看视频| 性少妇av在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产成人精品无人区| 一级毛片女人18水好多| 婷婷六月久久综合丁香| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲精品一二三| 十分钟在线观看高清视频www| 激情视频va一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 天堂动漫精品| 欧美一级毛片孕妇| 99久久人妻综合| 1024视频免费在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 黑丝袜美女国产一区| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲自拍偷在线| tocl精华| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品av久久久久免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| av在线播放免费不卡| 人人妻人人澡人人看| 97人妻天天添夜夜摸| 国产成人精品在线电影| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 免费在线观看黄色视频的| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 女人精品久久久久毛片| 自线自在国产av| 超色免费av| 老司机亚洲免费影院| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜久久久在线观看| 午夜免费成人在线视频| 99久久国产精品久久久| 亚洲精品在线美女| 麻豆av在线久日| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲精华国产精华精| 91九色精品人成在线观看| 91精品三级在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| bbb黄色大片| 日本黄色视频三级网站网址| av超薄肉色丝袜交足视频| av电影中文网址| 国产黄a三级三级三级人| 正在播放国产对白刺激| 丁香欧美五月| 国产精品亚洲av一区麻豆| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| tocl精华| 久久国产精品影院| 精品免费久久久久久久清纯| 久久精品国产综合久久久| 国产精品二区激情视频| xxx96com| 精品乱码久久久久久99久播| 伦理电影免费视频| 国产真人三级小视频在线观看| 国产麻豆69| 国产一区二区三区视频了| 久久久久久久久久久久大奶| 曰老女人黄片| 国产成人精品久久二区二区91| 精品卡一卡二卡四卡免费| 男女床上黄色一级片免费看| 搡老乐熟女国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产成人av教育| 久久精品91蜜桃| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美乱色亚洲激情| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 91精品三级在线观看| 高清在线国产一区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一级片'在线观看视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99在线视频只有这里精品首页| 在线观看66精品国产| 满18在线观看网站| www日本在线高清视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 日本免费a在线| 一区二区三区国产精品乱码| 女性生殖器流出的白浆| 欧美久久黑人一区二区| a级片在线免费高清观看视频| 欧美中文综合在线视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 少妇的丰满在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 麻豆国产av国片精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 咕卡用的链子| 天天添夜夜摸| 亚洲一区二区三区不卡视频| 色综合站精品国产| 午夜日韩欧美国产| 免费高清在线观看日韩| 91九色精品人成在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 色综合婷婷激情| 美女高潮到喷水免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲美女黄片视频| 中文字幕色久视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 麻豆一二三区av精品| 黄片小视频在线播放| 久久伊人香网站| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲成国产人片在线观看| 日本五十路高清| 99久久国产精品久久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线观看www视频免费| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看66精品国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成人精品在线电影| 国产伦一二天堂av在线观看| а√天堂www在线а√下载| 国产免费男女视频| 大型av网站在线播放| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久伊人香网站| 国产高清激情床上av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 啦啦啦免费观看视频1| 老司机福利观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲avbb在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 他把我摸到了高潮在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| www.999成人在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 成人18禁在线播放| 18禁国产床啪视频网站| 怎么达到女性高潮| 国产三级黄色录像| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产av精品麻豆| 亚洲国产欧美网| 免费高清在线观看日韩| 超碰成人久久| 亚洲五月天丁香| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产在线精品亚洲第一网站| 在线天堂中文资源库| 久久国产亚洲av麻豆专区| 90打野战视频偷拍视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久亚洲真实| 精品国产亚洲在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 搡老岳熟女国产| 一级片'在线观看视频| 国产主播在线观看一区二区| 日本免费a在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99在线视频只有这里精品首页| 三上悠亚av全集在线观看| 精品国产一区二区久久| 美女大奶头视频| 精品日产1卡2卡| 在线观看免费视频网站a站| 多毛熟女@视频| 精品国产美女av久久久久小说| 成人影院久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 淫秽高清视频在线观看| 欧美性长视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产真人三级小视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 午夜免费观看网址| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女高潮到喷水免费观看| 黑人操中国人逼视频| 男女之事视频高清在线观看| 久久国产精品影院| 久9热在线精品视频| 国产深夜福利视频在线观看| 91麻豆av在线| 1024香蕉在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 免费高清在线观看日韩| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩黄片免| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线视频色国产色| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲久久久国产精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 黄色视频,在线免费观看| www日本在线高清视频| 麻豆av在线久日| 不卡一级毛片| 操美女的视频在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 长腿黑丝高跟| 香蕉久久夜色| 久久精品91无色码中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av | av在线播放免费不卡| 欧美大码av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 91九色精品人成在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产视频一区二区在线看| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品久久久av美女十八| 黄色怎么调成土黄色| www.999成人在线观看| 亚洲国产欧美网| 欧美成人性av电影在线观看| 麻豆成人av在线观看| 一级作爱视频免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91大片在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产精品久久久av美女十八| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产成人精品在线电影| 老司机在亚洲福利影院| 欧美色视频一区免费| 国产av在哪里看| 国产激情久久老熟女| 亚洲久久久国产精品| 91九色精品人成在线观看| 夜夜爽天天搞| 麻豆久久精品国产亚洲av | 亚洲精品一二三| 看片在线看免费视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99精品久久久久人妻精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 黄色视频不卡| 不卡av一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 97碰自拍视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品美女久久av网站| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精华国产精华精| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 99国产精品免费福利视频| 国产熟女xx| 中亚洲国语对白在线视频| 久久久久久人人人人人| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲av成人av| 国产精品乱码一区二三区的特点 | xxxhd国产人妻xxx| 香蕉丝袜av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 无人区码免费观看不卡| 久热这里只有精品99| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美成人性av电影在线观看| 丝袜在线中文字幕| 国产成人欧美在线观看| 深夜精品福利| 亚洲一区二区三区不卡视频| 桃红色精品国产亚洲av| 91成人精品电影| 久久午夜综合久久蜜桃| 99精国产麻豆久久婷婷| 中文亚洲av片在线观看爽| 很黄的视频免费| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲av片天天在线观看| 午夜福利在线观看吧| 999久久久国产精品视频| 国产亚洲欧美精品永久| 国产午夜精品久久久久久| 色老头精品视频在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品久久久av美女十八| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲久久久国产精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 制服诱惑二区| 99re在线观看精品视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 交换朋友夫妻互换小说| 大型黄色视频在线免费观看| 成人18禁在线播放| 免费高清在线观看日韩| 中文亚洲av片在线观看爽| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费在线观看完整版高清| 无限看片的www在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 成人三级黄色视频| 黄色怎么调成土黄色| 在线看a的网站| 12—13女人毛片做爰片一| 99久久综合精品五月天人人| 啦啦啦 在线观看视频| 色老头精品视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 久热爱精品视频在线9| 精品久久久久久电影网| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 后天国语完整版免费观看| 国产不卡一卡二| 久久 成人 亚洲| 1024视频免费在线观看| 国产av精品麻豆| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品一区二区三区四区五区乱码| 18禁国产床啪视频网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 一区在线观看完整版| 午夜a级毛片| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲成人免费av在线播放| 我的亚洲天堂| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| www国产在线视频色| 国产欧美日韩一区二区三| 91在线观看av| 18禁国产床啪视频网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲美女黄片视频| 青草久久国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜视频精品福利| 中文欧美无线码| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久精品人人爽人人爽视色| 99精品在免费线老司机午夜| 久热这里只有精品99| 大码成人一级视频| 国产精品影院久久| 成人黄色视频免费在线看| 一区二区三区激情视频| 亚洲五月天丁香| 老司机在亚洲福利影院| 高清黄色对白视频在线免费看| 又黄又粗又硬又大视频| 大陆偷拍与自拍| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 两个人免费观看高清视频| 日韩欧美在线二视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人三级黄色视频| 国产成人欧美在线观看| 国产xxxxx性猛交| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品久久久av美女十八| 性欧美人与动物交配| 色在线成人网| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲三区欧美一区| 久久久久九九精品影院|