影響非洲豬瘟病毒核酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵技術(shù)

鄭梅紅

（舞鋼市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 舞鋼 462500）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染導(dǎo)致的一種急性、熱性、高度接觸性烈性傳染病，雖不屬于人畜共患，但一旦發(fā)生，對養(yǎng)豬業(yè)的影響幾乎是滅頂之災(zāi)。非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室病毒核酸檢測是一種簡單、快捷的病原學(xué)檢測方法，但由于病毒核酸檢測對環(huán)境和操作過程要求十分嚴(yán)格，所以為了提高非洲豬瘟病毒核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，對非洲豬瘟病毒核酸進(jìn)行檢測時(shí)，檢測員必須認(rèn)真對待每一個(gè)操作細(xì)節(jié)。筆者根據(jù)多年來的實(shí)驗(yàn)室檢測經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合部分參考文獻(xiàn)，整理歸納，總結(jié)出了影響實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒核酸檢測準(zhǔn)確性的幾個(gè)要點(diǎn)。

1 非洲豬瘟病毒核酸檢測的重要性

1.1 非洲豬瘟病毒的性質(zhì)

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染導(dǎo)致的一種急性、熱性、高度接觸性烈性傳染病，發(fā)病時(shí)間短（2～21 d）、發(fā)病率和死亡率95%以上，有時(shí)甚至可達(dá)到100%，由此我國將此病列為一類動物疫病。其病毒基因型多（24個(gè)基因型、9個(gè)血清型），易突變，導(dǎo)致病毒存活時(shí)間久（25～37 ℃存活數(shù)月，4℃存活1年以上，冷凍或者腌肉可以達(dá)數(shù)年至數(shù)十年）、抵抗力強(qiáng)（耐酸堿pH 4-10時(shí)也很穩(wěn)定、反復(fù)凍融不影響病毒活力），很多臨床癥狀和普通豬瘟非常相似，到目前為止還沒有有效的疫苗和藥物來阻止病毒的侵襲，依靠實(shí)驗(yàn)室檢測才能對其進(jìn)行確診。

1.2 非洲豬瘟病毒核酸檢測技術(shù)的發(fā)展及其重要性

非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測方法雖然理論上有多種，但由于影響因素太多，有些操作起來非常困難，常常導(dǎo)致試驗(yàn)失敗；有些反應(yīng)時(shí)間太長，滿足不了急需。這兩年隨著先進(jìn)儀器的生產(chǎn)，檢測技術(shù)的提升，對非洲豬瘟的檢測無論從結(jié)果的精準(zhǔn)度和檢測時(shí)間的縮短上都提高了很多。目前非洲豬瘟病毒核酸檢測是診斷非洲豬瘟的重要措施之一，其準(zhǔn)確率幾乎達(dá)到100%，方法簡單快捷。以鄭州某生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒為例，操作過程也僅僅只需30 多分鐘，然后放入PCR 分析儀再進(jìn)行讀取結(jié)果，縣級實(shí)驗(yàn)室和條件好一點(diǎn)的養(yǎng)殖場都可以開展。如發(fā)現(xiàn)疑似就近立即進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測，這也是迅速控制非洲豬瘟擴(kuò)散和傳播最關(guān)鍵的一步。但由于這種檢測方法靈敏度高、特異性高，受外界影響因素復(fù)雜，所以在檢測過程中有許多細(xì)節(jié)必須注意，絕不能掉以輕心。做好實(shí)驗(yàn)室檢測，早發(fā)現(xiàn)早處理，嚴(yán)禁病毒進(jìn)一步擴(kuò)散，這也是我們獸醫(yī)工作者的艱巨任務(wù)。

2 檢測時(shí)細(xì)節(jié)的注意事項(xiàng)

下面以實(shí)驗(yàn)室最常用的熒光PCR 檢測方法為例，結(jié)合筆者多年來的實(shí)驗(yàn)室檢測經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合部分參考文獻(xiàn)，以操作過程中可能會出現(xiàn)影響結(jié)果準(zhǔn)確性的一些因素以及如何避免這些問題，總結(jié)出以下幾條影響非洲豬瘟病毒核酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵技術(shù)。

2.1 樣品處理和保存

全血、血清和血漿可直接進(jìn)行下一步試驗(yàn)，淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體、肌肉等組織需加生理鹽水或者PBS 液進(jìn)行研磨。研磨不能用金屬轉(zhuǎn)頭，研磨時(shí)必須研細(xì)均勻，研磨組織不能過大，以免雜質(zhì)含量過高而抑制后續(xù)的PCR 反應(yīng)，然后離心抽取上清液進(jìn)行檢測。樣品混樣時(shí)，一孔內(nèi)盡量是同一圈舍的樣品，或者是一個(gè)豬場的樣品。一孔內(nèi)樣品份數(shù)不能太多（也有專家說一孔最多不能超過32 份）。如果樣品加樣量不夠，可以添加一些生理鹽水或者PBS 液再抽取，不然加樣量不準(zhǔn)確也會影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為避免病毒RNA/DNA 降解，提取后的樣品應(yīng)立即進(jìn)行檢測，不然會產(chǎn)生假陰性。不能立即檢測的，如在2 h 內(nèi)檢測，應(yīng)置于4 ℃環(huán)境中，3 個(gè)月內(nèi)檢測應(yīng)置于-20 ℃以下冰箱內(nèi)保存，如果長期保存應(yīng)置于-70℃以下。避免樣品反復(fù)凍融。非洲豬瘟病毒檢測時(shí)樣品最好現(xiàn)提取現(xiàn)用。

經(jīng)裂解處理的樣品，不能用于樣品保存，僅用于即時(shí)檢測。

2.2 樣品的滅活

試驗(yàn)前對樣品在水浴鍋內(nèi)經(jīng)過60 ℃30 min 的滅活處理，可有效殺滅樣品內(nèi)非洲豬瘟病毒的感染力，并保持其活力，也能有效殺滅其他病毒的特異性，不至于影響試驗(yàn)效果。

2.3 檢測試劑的正確保管和使用

檢測試劑必須嚴(yán)格按試劑盒說明要求的溫度保存；嚴(yán)禁使用超過有效期的試劑；不同批號的試劑勿混用；避免試劑長時(shí)間打開。

實(shí)驗(yàn)前先拿出所需試劑，試劑溶化或者恢復(fù)室溫后，根據(jù)試劑說明書，充分混勻所需試劑，同時(shí)注意避免混勻時(shí)用力過猛，產(chǎn)生氣泡；PCR 反應(yīng)體系對光和溫度特別敏感，保存和使用時(shí)外面要裹上一層不透明的錫紙，加PCR 反應(yīng)體系時(shí)，不要開啟生物安全柜內(nèi)的燈光；使用時(shí)拿出冰箱，溶化后方可正常使用，使用后再立即放入冰箱冷凍。反應(yīng)體系和陰陽對照凍融次數(shù)越少越好（最好不要超過3 次），保質(zhì)期最好不要超過半年，反復(fù)凍融易失活。

2.4 實(shí)驗(yàn)室檢測區(qū)域必須確保無菌狀態(tài)

檢測前檢測區(qū)域及空間和實(shí)驗(yàn)臺面都要進(jìn)行一次徹底消毒和清潔。結(jié)束后仍要及時(shí)對臺面進(jìn)行消毒和清潔。生物安全柜先通風(fēng)10 min 以抽出污染的氣溶膠，然后用紫外線消毒30 min 以上再使用。生物安全柜要合理分區(qū):潔凈區(qū)（左手邊放置槍頭、PCR 反應(yīng)管等）；實(shí)驗(yàn)操作區(qū)；污染區(qū)（右手邊放置廢液缸、10% 84 消毒液等）。加樣過程必須在經(jīng)過消毒處理過的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，同時(shí)開啟排風(fēng)系統(tǒng)。整個(gè)試驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)室門必須時(shí)刻保持關(guān)閉狀態(tài)。這是為成功的試驗(yàn)負(fù)責(zé)，也是為自身生物安全負(fù)責(zé)。

2.5 各實(shí)驗(yàn)區(qū)、器材、耗材不能交叉使用

病毒核酸提取試劑盒提取靶標(biāo)為病毒RNA/DNA,操作過程特別要防止RNA 或者DNA 的降解，所有使用的器皿、加樣器均為專用。病原學(xué)檢測各區(qū)域均為專用。各檢測室之間運(yùn)送物品必須經(jīng)傳遞窗口傳送，并且不得回流。離心管、槍頭等一次性耗材，用前需進(jìn)行高壓滅菌。操作人員應(yīng)戴無粉手套。加入反應(yīng)體系和加入核酸提取液分別在兩個(gè)不同的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。生物安全柜內(nèi)不要過載，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中所需物品都要在工作前放入，并且廢棄物缸要遠(yuǎn)離其他物品。

2.6 核酸提取時(shí)不能有任何污染

提取病毒核酸時(shí)，儀器必須先經(jīng)紫外線照射30 min以上，進(jìn)行消毒和滅菌。核酸提取時(shí)不能有任何病菌，特別是豬瘟陽性病毒的污染，不然會嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。核酸提取結(jié)束后，拿取吸附棒時(shí)動作一定要輕微，免得各孔相互污染。如果采集和制備過程中發(fā)生交叉污染，則容易出現(xiàn)假陽性。PCR 反應(yīng)管進(jìn)行加樣時(shí)，按照陰性對照、待檢樣品、陽性對照的順序加入，如果把陽性對照放在前面，檢測時(shí)會存在受陽性污染的風(fēng)險(xiǎn)。為防止熒光的干擾，要使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套，避免用手直接接觸，請勿在PCR 反應(yīng)管上標(biāo)記。同時(shí)吸取核酸提取液時(shí)，盡量避免吸取磁珠。

上機(jī)前注意檢查PCR 反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。

2.7 加樣量必須確保準(zhǔn)確

提取病毒核酸時(shí)，一定要按照說明書上的指定孔準(zhǔn)確加量。特別是向PCR 反應(yīng)管加入檢測樣品、陰陽對照，由于加樣量很小，吸取后一定要再次確認(rèn)有無吸取以及吸取容量，加入時(shí)吹打動作一定要干脆麻利，吹打干凈，打入時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。完全加樣后瞬時(shí)離心，讓加樣物全部沉入孔底，避免PCR 反應(yīng)管放入PCR 分析儀讀取結(jié)果時(shí)出現(xiàn)誤差。

2.8 必須做好自我防護(hù)

整個(gè)試驗(yàn)過程中必須穿上防護(hù)服、一次性手套（無粉塵不含熒光物質(zhì)）、口罩、帽子、鞋套、護(hù)目鏡，一旦發(fā)現(xiàn)有污染風(fēng)險(xiǎn)，必須更換。試驗(yàn)過程中絕不能在無菌室內(nèi)從事任何無關(guān)試驗(yàn)的活動。用過的廢棄物及時(shí)進(jìn)行歸類滅菌處理。

2.9 廢棄物應(yīng)及時(shí)處理

因檢測的樣本可能含有病毒，雖然經(jīng)過試劑裂解后一般無生物污染性，但仍需要按照有生物污染性對待，使用過的試劑預(yù)裝板及攪拌棒要及時(shí)安全棄置。采樣所用器械及檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時(shí)歸類高壓滅菌處理。檢測過程中用過的吸頭應(yīng)直接打到盛有10%的巴氏消毒液或者0.8%的氫氧化鈉溶液的帶蓋的廢棄物缸中。反應(yīng)后的PCR 反應(yīng)管嚴(yán)禁開蓋和高壓處理。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)已耗材料和儀器未經(jīng)處理不得移出。

3 總結(jié)

病原學(xué)檢測對試驗(yàn)環(huán)境和試驗(yàn)操作的要求非常嚴(yán)格，每一步都必須嚴(yán)格按照試劑盒說明書上的要求進(jìn)行操作。對試劑的保管也必須按各自的要求放在合適的溫度環(huán)境中。影響檢測結(jié)果的每一個(gè)技術(shù)關(guān)鍵必須牢記在心。試驗(yàn)過程中如發(fā)現(xiàn)問題立即上報(bào)，以便快捷、妥善處理。