高通量測(cè)序分析六味地黃湯對(duì)肝腎陰虛型妊娠期便秘患者腸道菌群的影響*

周平，殷文靜，溫濟(jì)英，梁海英，邢佳玲，陳丹玲

(廣東省婦幼保健院 婦產(chǎn)科，廣東 廣州 511400)

功能性便秘作為一種常見(jiàn)的胃腸功能失調(diào)疾病，由非器質(zhì)性因素引起排便間隔時(shí)間延長(zhǎng)、糞便干結(jié)及排便困難為主要臨床特征[1]。孕婦由于孕激素分泌增多、增大的子宮壓迫胃腸道及直腸、飲食結(jié)構(gòu)不合理及日?；顒?dòng)量減少等因素，常發(fā)生妊娠期功能性便秘，且近年來(lái)發(fā)病率逐年上升[2-3]。妊娠期便秘若不及時(shí)干預(yù)可引發(fā)宮縮、出現(xiàn)流產(chǎn)或早產(chǎn)，甚至誘發(fā)心血管疾病如子癇前期等并發(fā)癥。目前臨床上對(duì)于妊娠期便秘的處理大都選擇口服乳果糖等瀉劑治療或口服益生菌等微生態(tài)治療，但這類方法易產(chǎn)生依賴性及出現(xiàn)腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)[4]。中藥輔助治療妊娠期功能性便秘因其副作用低、依賴性低及復(fù)發(fā)率低等特點(diǎn)，已被越來(lái)越多的患者接受[5]。功能性便秘的病理生理機(jī)制復(fù)雜尚未完全明確，普遍觀點(diǎn)認(rèn)為腸道菌群的改變是功能性便秘的主要發(fā)病機(jī)制[6-7]。隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，高通量焦磷酸測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于腸道菌群分析[8]。六味地黃湯作為經(jīng)典的滋腎補(bǔ)陰湯劑，尚無(wú)研究將其應(yīng)用于治療肝腎陰虛型妊娠期便秘。因此，本研究擬通過(guò)采用高通量焦磷酸測(cè)序分析六味地黃湯對(duì)肝腎陰虛型妊娠期便秘患者腸道菌群的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1—5月門診產(chǎn)檢并診斷為肝腎陰虛型妊娠期便秘患者28例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，即西醫(yī)診斷參照功能性便秘羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]、中醫(yī)診斷參照《中藥新藥臨床指導(dǎo)原則》中的標(biāo)準(zhǔn)，辨證為肝腎陰虛型[10]；(2)近6個(gè)月未使用抗生素、益生菌和其他導(dǎo)致便秘的藥物；(3)簽署知情同意書，依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有自發(fā)性流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)及妊娠劇吐等合并癥史；(2)由其他疾病引起的便秘，如腸梗阻，炎癥性腸病等；(3)有明顯心血管、呼吸、消化、血液、內(nèi)分泌、神經(jīng)或精神等疾??；(4)患者實(shí)驗(yàn)期間使用其它影響療效藥物、 出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)不能堅(jiān)持參與實(shí)驗(yàn)或失訪者，視為退出病例。28例妊娠期便秘患者年齡20～35歲、平均(28.34±6.13)歲，孕周20～26周、平均(25.46±4.32)周，病程7～14 d、平均(12.65±4.89)d。

1.2 方法

1.2.1治療方法 所有患者均予六味地黃湯藥方(火麻仁30 g，熟地黃、桑椹子、山藥、肉蓯蓉、玄參、麥冬各15 g，山茱萸、茯苓各10 g，砂仁和炙甘草各6 g)治療，加水750 mL/劑，浸泡30 min，煎至250 mL，1次/d，分早晚2次溫水送服，持續(xù)2周，并囑患者服藥期間清淡飲食、合理運(yùn)動(dòng)、忌寒涼、增加富含粗纖維的蔬菜和水果、適量攝入雜糧及保持規(guī)律作息等，若發(fā)現(xiàn)任何身體不適，立刻停止用藥。

1.2.2糞便取樣和16S rRNA細(xì)菌檢測(cè) 六味地黃湯治療前，采用無(wú)菌棉簽取所有患者清晨自然排出的新鮮糞便50 g置于大便盒中，并將大便盒和冰塊置于盒子里共同送至實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)驗(yàn)室分裝后放入-80 ℃冰箱保存；服藥2周后對(duì)患者進(jìn)行隨訪并再次留取患者的糞便。采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒(批號(hào)51504，德國(guó)QIAGEN)抽提治療前后糞便樣本的總基因組脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增獲得16S rRNA基因V4標(biāo)簽片段，構(gòu)建Illumina平臺(tái)文庫(kù)，并于Illumina平臺(tái)測(cè)序。

1.2.3腸道菌群樣本生物信息分析 采用高通量測(cè)序技術(shù)分析菌群的變化，使用v1.8.0 定量分析微生物生態(tài)學(xué)(quantitative insights into microbial ecology，QIIME)軟件將操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)(v132)比對(duì)注釋；根據(jù)OTU分析結(jié)果，進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析；采用Chao1指數(shù)計(jì)算菌群豐度，采用Shannon和Simpson指數(shù)計(jì)算菌群多樣性，同時(shí)對(duì)OTU表格進(jìn)行稀釋，并繪制稀釋曲線。通過(guò)從每個(gè)樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，可以預(yù)測(cè)樣本在一系列給定測(cè)序深度下所可能包含的物種總數(shù)及其中每個(gè)物種的相對(duì)豐度[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 稀釋曲線分析

所有患者在治療過(guò)程中無(wú)明顯不良反應(yīng)，無(wú)退出研究的病例。從稀釋曲線可得知，隨著樣本量的加大，曲線表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，說(shuō)明有大量的物種被發(fā)現(xiàn)；曲線逐漸趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理；基本能覆蓋樣本中所有的細(xì)菌種類，可以用于后續(xù)分析。見(jiàn)圖1。

2.2 腸道菌群豐度和多樣性

治療后妊娠期便秘患者腸道菌群的Chao1指數(shù)高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 治療前后腸道菌群的豐度和多樣性Fig.2 Comparison of abundance and diversity of intestinal flora before and after treatment

2.3 菌群的門、屬分類

治療前后，患者腸道菌群在門水平中均以bacteroidetes、firmicutes和proteobacteria均為高豐度優(yōu)勢(shì)菌群，但治療前后菌群相對(duì)豐度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)；在屬水平進(jìn)行分析，治療前后共有30個(gè)菌群豐度發(fā)生改變，治療前妊娠期便秘患者腸道菌群相對(duì)豐度排前5的菌屬分別為bacteroidetes、faecalibacterium、prevotella_9、subdoligranulum及l(fā)achnospira，治療后相對(duì)豐度排前5的菌屬分別為bacteroidetes、prevotella_9、faecalibacterium、blautia及l(fā)achnoclostridium(圖4)。通過(guò)LefSe技術(shù)分析尋找有顯著差異性的菌屬，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)六味地黃湯治療后，妊娠期便秘患者糞便菌群中共有10個(gè)菌屬豐度發(fā)生明顯改變，Escherichia、alistipes、parabacteroides、bacteroidesfragilis及coprococcus菌屬豐度較治療前明顯降低，F(xiàn)aecalibacterium、roseburia、bifidobacterium、prevotella及l(fā)actobacillus菌屬豐度較治療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖3 治療前后腸道菌群在門水平的高豐度物種分布Fig.3 Distribution of high abundance species of intestinal flora at portal level before and after treatment

圖4 治療前后腸道菌群在屬水平的物種相對(duì)豐度分布Fig.4 Relative abundance distribution of intestinal flora at genus level before and after treatment

圖5 治療前后腸道菌群LefSe分析Fig.5 LefSe analysis of intestinal flora before and after treatment

3 討論

腸道菌群已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，它與人體健康息息相關(guān)，在參與消化吸收、抵抗致病微生物定植、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育等方面均發(fā)揮著重要作用[12]。眾多研究表明，腸道菌群失調(diào)在功能性便秘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[13-14]。便秘在祖國(guó)醫(yī)學(xué)史上曾記載為“大便難”、“后不利”等[15]。《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》曰：“陰在內(nèi)，陽(yáng)之守也；陽(yáng)在外，陰之使也”。說(shuō)明陰與陽(yáng)之間相互促進(jìn)、相互制約、相互消長(zhǎng)，維持著相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡[16]。同理，腸道優(yōu)勢(shì)菌群與致病菌群之間，也存在相互制約又相互依存的關(guān)系，共同維持腸道微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡[17]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝主藏血，主疏泄，與膽相表里，腸道菌群比例失調(diào)，致病菌數(shù)量增加，從而產(chǎn)生內(nèi)毒素，使肝臟負(fù)荷加重，最終導(dǎo)致肝臟功能受損；腎主藏精，主水，主納氣，與膀胱相表里，而腎臟功能受損，體內(nèi)的廢物不能排出，停留在血管內(nèi)，隨著血液運(yùn)行到腸壁血管，進(jìn)入腸腔，進(jìn)而影響腸道微生態(tài)菌群，打破其平衡狀態(tài)[18]。六味地黃湯為肝、脾、腎三陰并補(bǔ)之劑，治以滋補(bǔ)腎陰為主，補(bǔ)瀉結(jié)合，開(kāi)合相濟(jì)[19]。

本研究采用Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)來(lái)反映腸道菌群的豐度及多樣性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)六味地黃湯治療前后，妊娠期便秘人群的腸道菌群在豐度有明顯差異，多樣性上暫未發(fā)現(xiàn)明顯改變，說(shuō)明六味地黃湯能改善菌群的相對(duì)豐度，但腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)也具有其穩(wěn)定性，同一物種的菌群組成是相對(duì)恒定的。上述結(jié)果與既往對(duì)功能性便秘患者腸道菌群的研究不一致。黃林生等[11]探討慢性功能性便秘患者與健康人群之間腸道菌群的差異，發(fā)現(xiàn)2組人群的菌群豐富度有顯著差異，而菌群多樣性無(wú)明顯差異。余莉等[20]研究發(fā)現(xiàn)老年人群與青年人群的菌群物種多樣性相似。各研究結(jié)果不同的原因在于：(1)研究對(duì)象不同，各研究對(duì)象在年齡、生活和飲食習(xí)慣等方面存在差異；(2)研究采用的分子生物學(xué)技術(shù)不統(tǒng)一，或研究采用的干預(yù)方式不一致。

本研究分析了妊娠期便秘患者經(jīng)六味地黃湯治療前后菌群在門水平和屬水平的主成分分布差異，發(fā)現(xiàn)在門水平中均以bacteroidetes、firmicutes和proteobacteria為高豐度優(yōu)勢(shì)菌群，且治療前后菌群的相對(duì)豐度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在屬水平中，治療前后均以bacteroidetes、prevotella_9 及faecalibacterium菌屬為主，共有30個(gè)菌屬發(fā)生改變。進(jìn)一步通過(guò)LefSe技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)六味地黃湯治療后，妊娠期便秘孕婦糞便菌群中共有10個(gè)菌屬豐度發(fā)生明顯改變。其中escherichia、alistipes、parabacteroides、bacteroidesfragilis、coprococcus菌屬豐度較治療前明顯降低，faecalibacterium、roseburia、bifidobacterium、prevotella、lactobacillus菌屬豐度較治療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。眾所周知，lactobacillus和bifidobacterium是公認(rèn)的益生菌，escherichia則是最常見(jiàn)的致病菌。Nabi等[21]發(fā)現(xiàn)服用含lactobacillus的制劑能顯著改善便秘患者的排便狀況。國(guó)外一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)與健康人群相比，腸易激綜合征患者的bifidobacterium水平明顯降低[22]。Wang等[23]在洛派丁胺誘導(dǎo)的便秘動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，bifidobacteriumadolescentisCCFM669、667可通過(guò)黏附在腸上皮細(xì)胞，產(chǎn)生丙酸、丁酸等來(lái)緩解便秘癥狀，同時(shí)治療后乳酸桿菌含量明顯增高，而梭菌屬含量降低。Wang等[24]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)lactobacillusreuterii和lactobacillusaci-dophilus菌群能夠促進(jìn)腸道的蠕動(dòng)，而escherichia則抑制腸道蠕動(dòng)。Escherichia菌屬作為與消化道癥狀最為相關(guān)的菌屬，其對(duì)“腸-腦”軸的影響也最大。Philip等[25]通過(guò)健康人群糞便樣品分析，得出產(chǎn)生γ-氨基丁酸的途徑和escherichia菌屬活躍表達(dá)密切相關(guān)。以上這些研究結(jié)論與本研究結(jié)論類似。Leonardo等[26]研究發(fā)現(xiàn)，功能性便秘人群的bacteroides、faecalibacterium、alistipes、lachnospira及coprococcus菌屬比健康人群豐度多；黃林生等[11]比較慢性功能性便秘與健康成年人群腸道菌群的差異，發(fā)現(xiàn)bacteroides、parabacteroides等菌屬在便秘病人的腸道中豐度增多，而prevotella_2及prevotella_9等菌屬在正常人群的腸道菌群中豐度增高。但Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn)prevotella菌屬豐度在便秘人群中下降，firmicutes豐度升高，而bifidobacterium和lactobacillus豐度卻沒(méi)有出現(xiàn)降低。這個(gè)結(jié)論的不一致，考慮可能是因地域、標(biāo)本采集部位、實(shí)驗(yàn)對(duì)象及檢測(cè)方法等不同。

綜上所述，妊娠期便秘孕婦經(jīng)六味地黃湯治療后，其腸道菌群發(fā)生一定改變，以益生菌的相對(duì)增多和致病菌的相對(duì)減少為主。同時(shí)從側(cè)面說(shuō)明，六味地黃湯在治療妊娠期便秘上發(fā)揮了有效作用。